Clonagem, expressão e produção de proteínas recombinantes do plasma seminal de bovinos para potencial uso em meios de congelamento de sêmen

Abstract

A criopreservação de sêmen ainda representa um desafio significativo para a reprodução de diversas espécies de interesse zootécnico, especialmente devido às diferenças naturais na criotolerância dos gametas entre elas. Embora o plasma seminal seja removido durante o processo de criopreservação, vários estudos têm destacado seus efeitos benéficos sobre a proteção espermática, principalmente devido à presença de proteínas com propriedades protetoras. Diante disso, a utilização de proteínas recombinantes derivadas do plasma seminal de espécies com maior tolerância ao congelamento, como os bovinos, surge como uma alternativa promissora para melhorar a qualidade do sêmen de espécies mais sensíveis à criopreservação. O objetivo deste estudo foi produzir, expressar e purificar as proteínas recombinantes Binder of sperm protein (BSP5), Espermadesina (SPAD1) e Osteopontina (OPN) do plasma seminal bovino, espécie utilizada como modelo em razão de sua reconhecida tolerância à criopreservação. Foram testadas diferentes cepas da bactéria Escherichia coli utilizando o vetor de expressão pET28a. A expressão foi realizada em pequena e larga escala, seguida de purificação por cromatografia de afinidade em coluna de níquel, utilizando o sistema ÄKTA Start. A pureza das proteínas foi avaliada por eletroforese em gel de poliacrilamida, a concentração determinada pelo método Qubit, e a identidade confirmada por Western blotting. A cepa Arctic Express apresentou os melhores resultados para a expressão das proteínas recombinantes escolhidas. As proteínas BSP5 e SPAD1 foram produzidas, expressas e purificadas com sucesso, sendo obtidas em concentrações satisfatórias. No entanto, não foi possível expressar a proteína recombinante OPN. Os resultados obtidos mostraram que a metodologia empregada foi eficaz para a produção, expressão e purificação das proteínas BSP5 e SPAD1. Palavras-chave: proteína recombinante; osteopontina; espermadesina 1 criopreservação; espermatozoide;Semen cryopreservation remains a significant challenge for the reproduction of various livestock species, especially due to natural differences in gamete cryotolerance among them. Although seminal plasma is typically removed during the cryopreservation process, several studies have highlighted its beneficial effects on sperm protection, mainly due to the presence of proteins with protective properties. In this context, the use of recombinant proteins derived from the seminal plasma of species with higher cryotolerance, such as cattle, emerges as a promising alternative to improve semen quality in more cryosensitive species. The aim of this study was to produce, express, and purify the recombinant proteins Binder of Sperm Protein (BSP5), Spermadhesin (SPAD1), and Osteopontin (OPN) from bovine seminal plasma, a species used as a model due to its recognized tolerance to cryopreservation. Different strains of Escherichia coli were tested using the pET28a expression vector. Protein expression was performed on small and large scales, followed by affinity chromatography purification using a nickel column on the ÄKTA Start system. Protein purity was assessed by polyacrylamide gel electrophoresis, concentration was determined using the Qubit method, and identity was confirmed by Western blotting. The Arctic Express strain showed the best results for the expression of the selected recombinant proteins. BSP5 and SPAD1 proteins were successfully produced, expressed, and purified, and obtained in satisfactory concentrations. However, the expression of recombinant OPN was not successful. The results demonstrated that the methodology employed was effective for the production, expression, and purification of BSP5 and SPAD1 proteins. Keywords: recombinant spermadesin1 protein; cryopreservation; spermatozoa; osteopontin