Caracterização e Imunolocalização das Principais Enzimas Digestivas do Predador Podisus nigrispinus (Heteroptera: Pentatomidae)

Abstract

Considerando a importância do predador Podisus nigrispinus em programas de controle biológico de pragas e a escassez de estudos sobre as enzimas digestivas deste inseto, este trabalho teve como objetivo identificar, caracterizar e localizar as principais enzimas digestivas das glândulas salivares e do intestino médio de P. nigrispinus. Machos adultos de P. nigrispinus foram dissecados sendo as glândulas salivares e o intestino médio (dividido em anterior, médio e posterior) submetidas a testes enzimáticos para amilase, aminopeptidase, catepsina L, tripsina e α-glicosidase. Estas enzimas foram pré-purificadas e imunolocalizadas na região do intestino médio. O pH da glândula salivar foi 6,0 e do intestino médio foi de 5,6 na região anterior, 5,7 na mediana e 5,8 na posterior. A atividade específica das enzimas nas glândulas salivares e no intestino médio foi respectivamente: amilase 0,01, 21 mU/mg, aminopeptidase 0,19, 3 mU/mg, catepsina L 16, 3800 U/mg e α-glicosidase 0,27, 147 mU/mg de proteína. Tripsina não apresentou atividade no intestino médio, porém na glândula salivar sua atividade específica foi de 7 U/mg de proteína. Catepsina L foi a principal proteinase encontrada em P. nigrispinus e apresentou dois picos de atividade com pH ótimo 5,5 e massa molecular de 14 e 17 e Km de 32 e 11 μM.. Amilase, aminopeptidase, α-glicosidase apresentaram um pH ótimo de 5,1, 5,5, 5,8; Km de 0,1%, 0,03, 5 mM e massa molecular de 43, 125 e 90 respectivamente. Insetos alimentados há uma hora apresentaram diferenças na atividade enzimática de todas as enzimas analisadas e se manteve similar nos outros tempos. Os dados bioquímicos e da imunolocalização mostraram que a amilase, aminopeptidase e α-glicosidase de membrana foram as enzimas mais ativas na região anterior do intestino; já nas regiões mediana e posterior todas as enzimas estão ativas, porém com uma maior atividade de catepsina L e α-glicosidase solúvel. Estes dados mostram que a digestão inicial de carboidratos inicia na região anterior do intestino médio e termina na anterior e mediana. Já a digestão de proteínas tem o início na região mediana e termina na anterior do intestino médio, sugerindo que a membrana perimicrovilar nestes insetos tem um papel na compartimentação da digestão, na qual a anterior está relacionada à absorção de água e também na absorção de aminoácidos obtidos do xilema por esses insetos zoofitófagos.

Considering the importance of the predator Podisus nigrispinus in programs of biological control of pests and the poor studies on the digestive enzymes in Hemiptera, this study aimed to identify, locate and characterize the major digestive enzymes of the salivary glands and midgut of P. nigrispinus. Adult males of P. nigrispinus were dissected and the salivary glands and midgut (divided into anterior, middle and posterior) subjected to enzyme tests for amylase, aminopeptidase, cathepsin L, trypsin and α-glucosidase. These enzymes were pre-purified and immunolocalized in the midgut regions. The pH was 6.0 in salivary gland and 5.6, 5.7 and 5.8 in the anterior, median and posterior regions of the midgut, respectively. The specific activity of enzymes in the salivary glands and midgut were respectively: amylase 0.01, 21 mU / mg, aminopeptidase 0.19, 3 mU / mg, cathepsin L 16, 3800 U / mg and α-glucosidase 0.27, 147 mU / mg protein. Trypsin was not active in the midgut, whereas in salivary gland its specific activity was 7 U / mg protein. Cathepsin L was the major proteinase in P. nigrispinus and showed two peaks of activity with optimum pH 5.5 and molecular mass of 14 and 17 kDa and Km 32 and 11 mM. Amylase, aminopeptidase, α-glucosidase had an optimum pH of 5.1, 5.5, 5.8, Km of 0.1%, 0.03, 5 mM and the molecular mass of 43, 125 and 90 kDa respectively. One hour after feeding, P. nigrispinus showed differences in activity of all enzymes tested and remained similar at other periods after feeding. The biochemical and immunolocalization data showed that the amylase, aminopeptidase and α-glucosidase membrane enzymes were more active in the anterior midgut, already in the middle and posterior all the enzymes were active, but with a higher activity of cathepsin L and soluble α-glucosidase. These data show that the initial digestion of carbohydrates begins in the anterior midgut and ends at the anterior and middle midgut, whereas digestion of proteins has its beginning in the middle, and ends at the anterior midgut, suggesting that the perimicrovilllar membrane play a role in compartmentalization of digestion in which the anterior midgut is related to water absorption and amino acid uptake obtained from xylem in this zoophytophagous insects.