Modelagem molecular e cinética enzimática: análises da inibição de tripsinas de pragas Lepidoptera por proteínas envolvidas na defesa de plantas

Abstract

Inibidores de proteases (IPs) são considerados uma alternativa mais sustentável aos pesticidas inorgânicos comumente utilizados no controle de pragas. A atuação de IPs nas tripsinas digestivas de herbívoros gera impactos negativos em parâmetros do ciclo de vida destes, como sobrevivência, peso larval e oviposição. Embora existam IPs naturais com atividade inseticida satisfatória, muitos destes são superados pelos insetos através da expressão de novas proteases. Além disso, inibidores de tripsinas naturais são moléculas grandes, aumentando as chances de serem clivados e inativados por outras enzimas proteolíticas. Sendo assim, o desenvolvimento de inibidores de proteases orgânicos de pequenas cadeias de resíduos de aminoácidos e alta especificidade a tripsinas do intestino médio de herbívoros, pode auxiliar no controle de pragas agrícolas. Assim, neste estudo foi testado a capacidade de inibição de duas proteínas inhibitorias, ApTI (do inglês Adananthera pavonina trypsin inhibitor) e ILTI (do inglês Inga laurina trypsin inhibitor), sobre tripsinas das espécies Spodoptera cosmioides e Anticarsia gemmatalis, ambas as espécies pertencem à ordem Lepidoptera. O sítio de ligação e o potencial de inibir tripsina-like destas especies pelos inibidores foram avaliados por docking e dinâmica molecular, ensaios para caracterização de parâmetros cinéticos e ensaios biológicos, misturando os inibidores em dieta artificial. O objetivo foi analisar o potencial inibiotório destas proteínas e a partir dos resultados estruturais e bioquímicos obtidos, desenvolver peptídeos com alta capacidade inseticida, que possam ser utilizados como modelo para a produção de peptídeos miméticos, serem pulverizados nas plantas, ou gerar dados para o desenvolvimento de plantas transgênicas. Os inibidores ILTI e ApTI apresentam alto potencial biotecnológico como agentes contra insetos fitófagos Lepidoptera, inibindo tripsinas por inibição tight-binding, com características competitivas e não competitivas, respectivamente. A ação de ApTI e ILTI no desenvolvimento de larvas de S. cosmioides e A. gemmatalis mostra que estes inibidores influenciam a sobrevivência larval, indicando seu potencial tóxico. Os peptídeos derivados do sitio reativo do inibidor ILTI apresentam afinidade pelas enzimas tripsinas de S. cosmioides e reduzem sua atividade biológica, confirmando o potencial inibitório destes compostos. Palavras-chave: Proteínas-inibidores. Simulação de acoplamento molecular. Insetos. Peptídeos. Enzimas proteolíticas.Protein protease inhibitors (PIs) are considered a more sustainable alternative to inorganic pesticides commonly used for pest control. The action of PIs on herbivorous digestive trypsins negatively impacts parameters of their life cycle, such as survival, larval weight and oviposition. Although there are natural IPs with satisfactory insecticidal activity, many of these are overcome by insects through the expression of new proteases. In addition, natural trypsin inhibitors are large molecules, increasing the chances of being cleaved and inactivated by other proteolytic enzymes. Thus, the development of organic protease inhibitors of small amino acid residues chains and high specificity to herbivorous midgut trypsins may help control agricultural pests. Thus, in this study we tested the inhibitory capacity of two inhibitory proteins, ApTI (Adananthera pavonina trypsin inhibitor) and ILTI (Inga laurina trypsin inhibitor), on trypsins of Spodoptera cosmioides and Anticarsia gemmatalis species, both species belong to fear Lepidoptera. The binding site and the trypsin-like inhibiting potential of these species by inhibitors were evaluated by docking and molecular dynamics, assays for characterization of kinetic parameters and biological assays, mixing the inhibitors in artificial diet. The aim was to analyze the inhibitory potential of these proteins and from the structural and biochemical results obtained, develop peptides with high insecticide capacity, which can be used as a model for the production of mimetic peptides, be sprayed on plants, or generate data for development of transgenic plants. ILTI and ApTI inhibitors have high biotechnological potential as agents against Lepidoptera phytophagous insects, inhibiting trypsins by tight- binding inhibition, with competitive and non-competitive characteristics, respectively. The action of ApTI and ILTI on the development of S. cosmioides and A. gemmatalis larvae shows that these inhibitors influence larval survival, indicating their toxic potential. The peptides derived from the ILTI inhibitor reactive site have affinity for S. cosmioides trypsin enzymes and reduce their biological activity, confirming the inhibitory potential of these compounds. Keywords: Docking. Protein-inhibitors. Docking. Insects. Peptides. Proteolitic enzymes.