Padronização e otimização da técnica de detecção de atividade de catalase para amostras biológicas

Abstract

O estresse oxidativo pode ser compreendido como um desequilíbrio redox em que a produção de espécies reativas de oxigênio supera a capacidade neutralizadora dos sistemas antioxidantes endógenos, comprometendo a homeostasia celular. Entre os principais mecanismos de defesa antioxidante, destaca-se a enzima catalase, cuja atuação clássica na decomposição do peróxido de hidrogênio em água e oxigênio constitui um dos pilares da proteção contra danos oxidativos. Considerando a relevância histórica e metodológica da mensuração dessa atividade enzimática em estudos bioquímicos e biomédicos, o presente estudo teve como objetivo desenvolver o ensaio de catalase por meio de sua padronização para amostras de tecido, assegurando maior reprodutibilidade e confiabilidade analítica. Ademais, propõe-se a utilização de um novo tipo de amostra, baseado em sangue total, com o objetivo de ampliar a aplicabilidade do método e preservar a robustez técnica que tradicionalmente fundamenta as análises enzimáticas em pesquisas experimentais. Para tal, foram realizados experimentos quanto estabilidade do substrato enzimático e da solução de complexação. Otimizamos a frequência analítica da leitura espectrofotométrica transferindo a reação método de alto rendimento (High- Throughput Screening - HST). Além disso, foram coletados cérebro, fígado, coração, rim e sangue de camundongos Balb/C saudáveis, a fim de obter parâmetros de normalidade de U.mg-1 em cada tipo de amostra. Obteve-se a linearidade da atividade enzimática e estabeleceu-se os limites mínimo e máximo de U.mg-1 confiáveis para comparação de diferentes indivíduos. Além disso, observou-se grande variação nos valores de amostras de soro hemolisado se comparadas com soro não hemolisado, propomos a utilização de amostras de sangue total como um novo tipo de amostra externo a este erro instrumental. O novo método apresentou coeficiente de correlação, R2= 0,997 e coeficiente de variação (CV) igual a 2,43%. Os tecidos apresentaram diferentes níveis de atividade de catalase, cujas faixas de linearidade estão entre 1373 - 2200 U.mg -1 para fígado, 105,48 - 160, 05 U.mg-1 para rim, 90,30 - 96,34 U.mg -1 para coração, em torno de 7,93 U.mg-1 para cérebro, 30 U.mL-1 para soro e entre 300-500 U.mL-1 para amostras de sangue total. Portanto, a padronização e otimização garantiu resultados mais precisos, sensíveis e uma análise mais rápida e de baixo custo conferindo maior confiabilidade nos dados relativos às comparações entre diferentes indivíduos. Palavras-chave: atividade enzimática; catalase; padronização; estresse oxidativoOxidative stress can be understood as a redox imbalance in which the production of reactive oxygen species exceeds the neutralizing capacity of endogenous antioxidant systems, thereby compromising cellular homeostasis. Among the principal antioxidant defense mechanisms, the enzyme catalase stands out, whose classical role in the decomposition of hydrogen peroxide into water and oxygen constitutes one of the pillars of protection against oxidative damage. Considering the historical and methodological relevance of measuring this enzymatic activity in biochemical and biomedical studies, the present study aimed to develop a catalase assay through its standardization for tissue samples, ensuring greater reproducibility and analytical reliability. In addition, the use of a new type of sample, based on whole blood, is proposed in order to expand the applicability of the method while preserving the technical robustness that traditionally underlies enzymatic analyses in experimental research. For this purpose, experiments were conducted to evaluate the stability of the enzymatic substrate and of the complexation solution. We optimized the analytical reading frequency of the spectrophotometric measurement by transferring the reaction to a high-throughput screening (High-Throughput Screening – HST) method. In addition, brain, liver, heart, kidney, and blood samples were collected from healthy Balb/C mice in order to obtain normality parameters expressed as U·mg¹ for each type of sample. The linearity of enzymatic activity was obtained, and the minimum and maximum reliable limits of U·mg¹ were established for comparisons among different individuals. Furthermore, a large variation was observed in the values obtained from hemolyzed plasma samples when compared with non-hemolyzed serum; therefore, we propose the use of whole blood samples as a new sample type external to this instrumental error. The new method presented a correlation coefficient of R² = 0.997 and a coefficient of variation (CV) equal to 2.43%. The tissues exhibited different levels of catalase activity, whose linearity ranges were between 1373–2200 U·mg¹ for liver, 105.48–160.05 U·mg¹ for kidney, 90.30–96.34 U·mg¹ for heart, approximately 7.93 U·mg¹ for brain, 30 U·mL¹ for serum, and between 300–500 U·mL¹ for whole blood samples. Therefore, the standardization and optimization ensured more precise and sensitive results, as well as faster and lower-cost analysis, providing greater reliability in the data related to comparisons among different individuals. Keywords: enzymatic activity; catalase; standardization; oxidative stress