Diversidade de bactérias psicrotróficas proteolíticas de leite e presença do gene que codifica metaloprotease alcalina

Abstract

A diversidade genética entre 113 culturas de bactérias psicrotróficas proteolíticas isoladas de amostras de leite cru granelizado foi avaliada utilizando- se a técnica de RAPD. Foi constatada uma grande diversidade genética entre os isolados, indicando fontes de contaminação diversas. A presença do gene apr, que codifica metaloproteases termorresistentes, foi avaliada por PCR em 26 culturas controle e em 133 isolados psicrotróficos proteolíticos de leite cru resfriado e granelizado. Detectou-se a presença do amplificado do gene apr apenas nas culturas de referência Serratia marcescens ATCC 8100, Pseudomonas fluorescens ATCC 13525 e estirpes de P. aeruginosa ATCC 15442 e ATCC 27853. A presença do gene apr foi detectada na mistura de DNA dos isolados psicrotróficos proteolíticos que apresentaram características fenotípicas de espécies do gênero Pseudomonas, quais sejam, Gram-negativas, não fermentadoras, catalase e oxidase positivas. Os demais isolados Gram-negativos e os Gram-positivos, embora tenham apresentado atividade proteolítica, não apresentaram o amplificado do gene apr. A técnica de PCR permitiu identificar a presença de população acima de 10 5 UFC/mL de P. fluorescens inoculada em leite desnatado reconstituído após a extração do DNA total das bactérias. Entretanto, quando amostras de leite pasteurizado inoculado com populações variando de 10 5 a 10 8 UFC/mL foram analisadas por PCR, sem a etapa de extração do DNA total, o limite de detecção foi de 10 8 UFC/mL.

The genetic diversity of 113 cultures of proteolytic psychrotrophic bacteria isolated from raw milk collected from cooling tanks was analyzed by RAPD. A great genetic diversity was detected among these isolates indicating different sources of contamination. The presence of the apr gene, which codes a heat- resistant metalloprotease, was assessed by PCR in 26 type strains and in 136 proteolytic psychrotrophic bacteria isolated from raw milk. The presence of the apr gene was only detected in Serratia marcescens ATCC 8100, Pseudomonas fluorescens ATCC 13525 and, strains of P. aeruginosa ATCC 15442 and ATCC 27853. The apr gene was detected in total DNA extracted from proteolytic psychrotrophics that showed phenotypic characteristics belonging to Pseudomonads such as Gram-negative, non-fermentative, positive-catalase and positive-oxidase. The apr gene was not detected in the other Gram-negative and Gram-positive isolates studied although they have displayed proteolysis. The PCR technique identified the presence of Pseudomonas fluorescens when total DNA was extracted from skim milk previously inoculated with a bacterial population containing 10 5 CFU/mL. However, the detection limit of apr gene without the DNA extraction step was 10 8 CFU/mL in pasteurized milk.