Obtenção de linhagens de Streptococcus equinus HC5 com produção aumentada de bovicina HC5 por evolução adaptativa em laboratório

Abstract

A bacteriocina bovicina HC5, sintetizada por Streptococcus equinus HC5, é capaz de inibir o crescimento de diversos microrganismos patogênicos e deteriorantes de alimentos. Além disso, o peptídeo é termotolerante, resistente ao pH ácido e apresenta baixa toxicidade in vivo, o que confere vantagens para sua aplicação industrial. Obter maior rendimento de produção e efetiva recuperação é um dos principais gargalos para viabilizar o uso da bovicina HC5. Neste projeto, S. equinus HC5 foi submetido a diferentes temperaturas de incubação para avaliar os efeitos do estresse térmico no crescimento deste microrganismo. Posteriormente, foi utilizado a técnica de evolução adaptativa em laboratório (EAL) por estresse térmico com o objetivo de selecionar linhagens de S. equinus HC5 com maior produção de bovicina HC5. Foi observado, neste estudo, que a temperatura ótima de crescimento do S. equinus HC5 é 42 °C e que temperaturas maiores que 49 °C inibem completamente o crescimento da cultura. O processo de EAL em batelada foi mantido por 400 gerações (100 dias) em temperaturas de 47 °C e 48 °C. Oito linhagens com fenótipos distintos foram selecionadas, sendo que destas, duas apresentaram produção aumentada de bovicina HC5 entre 26% e 140% (P < 0,05). A linhagem com a maior produção da bacteriocina apresentou expressão diferencial dos genes biossintéticos da bovicina HC5, e foi observado maiores níveis de expressão do gene que codifica para o peptídeo precursor (bvcA) (P < 0,05). Além disso, as linhagens adaptadas apresentaram modificação na composição dos ácidos graxos de membrana, com aumento da concentração de ácidos graxos saturados (P < 0,05). A linhagem obtida ao final do processo de evolução apresentou maior resistência ao estresse térmico, demonstrando maior taxa de crescimento específico (µ = 1,33 ± 0,02 h -1) e biomassa (DO600nm = 4,03 ± 0,06) a 48 °C em relação à linhagem selvagem (µ = 0,98 ± 0,04 h - e DO600nm = 1,96 ± 0,12) (P < 0,05). Os resultados desta pesquisa indicam que a EAL é uma estratégia eficaz para a seleção de linhagens de S. equinus HC5 com produção aumentada da bacteriocina bovicina HC5.Palavras-chave: Bacteriocinas. Bactérias lácticas. Estresse térmico.

Bovicin HC5, a bacteriocin synthesized by Streptococcus equinus HC5, is capable of inhibiting the growth of several pathogenic and food-deteriorating microorganisms. Obtaining higher production yields and effective recovery is one of the main bottlenecks to enabling applied use of bovicin HC5. In this project, S. equinus HC5 was subjected to different incubation temperatures to evaluate the effects of heat stress on the growth of this bacterium. Subsequently, the technique of adaptive laboratory evolution (ALE) by heat stress was used in order to select S. equinus HC5 strains with higher production of bovicin HC5. It was observed in this study that the optimal temperature for growth of S. equinus HC5 is 42 °C and that temperatures higher than 49 °C completely inhibit growth. The batch ALE process was maintained for 400 generations (100 days) at temperatures of 47 °C and 48 °C. Eight strains with different phenotypes were selected, and of these, two showed increased production of bovicin HC5 between 26% and 140% (P < 0.05). The strain with the highest bacteriocin production showed differential expression of the bovicin HC5 biosynthetic genes, and higher expression of the gene encoding the precursor peptide (bvcA) (P < 0.05). In addition, the adapted strains showed changes in the composition of membrane fatty acids, with an increase in the concentration of saturated fatty acids (P < 0.05). Furthermore, the final strain obtained in the evolution process showed greater resistance to heat stress, obtaining a higher specific growth rate (µ = 1.33 ± 0.02 h -1) and biomass (OD600nm = 4.03 ± 0.06) at 48 °C than the wild-type strain (µ = 0.98 ± 0.04 h-1 and OD600nm = 1.96 ± 0.12) (P < 0.05). The results presented in this study indicate that ALE is an effective strategy to select S. equinus HC5 strains with increased production of bacteriocin bovicin HC5. Keywords: Bacteriocins. Lactic acid bactéria. Thermal stress.