Chemical-nutritional composition of processed pearl millet (Pennisetum glaucum (L.) R. Br.) and its effects on intestinal health, iron metabolism, oxidative stress and inflammation

Abstract

Millets, in addition to being nutritious, providing carbohydrates, proteins, dietary fiber, resistant starch and minerals with iron, are low cost and have the potential to be environmentally sustainable and resistant, being a promising option to overcome situations of food and nutritional insecurity. In Brazil, the most widespread millet species is Pennisetum glaucum. This grain has a good chemical composition; however, the presence of phytochemicals, such as phytates, can compromise its nutritional quality. Therefore, it is recommended to consume the whole grain subjected to processing, such as germination and extrusion cooking, to preserve or improve its nutritional value. In addition, the inclusion of this cereal in the diet could minimize metabolic changes in the body, due to its good iron bioavailability, potential antioxidant and anti-inflammatory effect, and improvement of intestinal health. Objective: to evaluate the chemical-nutritional composition of millet (Pennisetum glaucum (L.) R. Br.) subjected to different processing methods and its effects on intestinal health, iron metabolism, oxidative stress, and inflammation. Methodology: this study was divided into three phases. In the first phase (biological assay I, article 1), the effects of the consumption of germinated pearl millet (raw millet flour) on the microbiota composition and intestinal morphology of rats fed with high saturated fat and fructose diet (HFHF) were investigated. For this, the animals were initially divided into two groups: AIN-93M and HFHF, for 8 weeks, to induce metabolic changes. Subsequently, the animals in the AIN-93M group were maintained and the HFHF group was divided into HFHF (HFHF diet) and HFHF + millet (HFHF + germinated millet flour) for 10 weeks. In the second phase (chemical-nutritional composition and in vitro iron bioavailability, article 2), the chemical-nutritional composition of pearl millet flours with different processing was performed: non-germinated open-pan cooked millet flour (NGOPCMF); germinated open-pan cooked millet flour (GOPCMF) and extrusion-cooked millet flour (ECMF), and their respective in vitro iron bioavailability using Caco-2 cells. In the third phase (biological assay II, articles 3 and 4), the effects of the consumption of pearl millet subjected to different processing (cooked millet flours) on iron metabolism, intestinal health, oxidative stress and inflammation were analyzed in rats induced to iron deficiency, through the depletion method (animals receiving a standard iron-free diet, SD iron-free, for 28 days, to induce iron deficiency) and hemoglobin repletion (animals separated into 4 groups for treatment: 1 control group, which received ferrous sulfate as an iron source (SD+FS) and 3 test groups, which received non- germinated open-pan cooked millet flour (SD+ NGOPCMF), germinated open-pan cooked millet flour (SD+ GOPCMF) or extrusion-cooked millet flour (SD+ ECMF), for 21 days). Results: Article 1: Raw germinated pearl millet flour reduced the genus Oscillibacter and the phylum Desulfobacterota, while increasing the family Eggerthellaceae. In addition, it increased beta diversity, cecum weight, cecum/body weight ratio, crypt depth and thickness, goblet cell count, and the concentration of SCFA propionate, and reduced fecal pH and urinary mannitol excretion. Article 2: Regarding the chemical composition of cooked pearl millet flours, when compared to NGOPCMF, ECMF showed an increase in the contents of carbohydrates, tryptophan, iron, manganese, total saturated fatty acids, diosmin, and cyanidin, and a reduction in total dietary fiber, resistant starch, and total monounsaturated and polyunsaturated fatty acids. On the other hand, GOPCMF showed an increase in the content of lysine, total polyunsaturated fatty acids and vitamin C and a reduction in the contents of phytate, total saturated and monounsaturated fatty acids and riboflavin. In addition, both flours (GOPCMF and ECMF) demonstrated an increase in the concentrations of essential and non-essential amino acids and a reduction in the concentrations of total lipids and total vitamin E. In the in vitro assay, the concentration of ferritin was higher in Caco-2 cells exposed to GOPCMF and ECMF compared to NGOPCMF. Article 3: The SD+GM group showed an increase in the expression of the DcytB, ferroportin and hephaestin genes. The SD+EM group showed an increase in the concentration of transferrin compared to the SD+FS group and serum iron, compared to the other groups, and a reduction in the total antioxidant capacity (TAC) of the liver. In the SD+CM group, there was an increase in the expression of ferritin. All test groups (SD+CM, SD+GM and SD+EM) demonstrated an increase in the gene expression of DMT1 and hephaestin, as well as in the serum iron concentration and a reduction in the gene expression of transferrin, Nrf2 and TNF and in the levels of MDA, NO, SOD and CAT in relation to the SD+FS group. Article 4: Animals fed with pearl millet flours subjected to different processing (SD+NGOPCMF, SD+GOPCMF and SD+ECMF) demonstrated a higher Chao index in the microbiome and a higher number and area of goblet cells and longitudinal muscle layer width. The SD+NGOPCMF and SD+GOPCMF groups demonstrated increased cecum weight, crypt depth, crypt thickness, and circular muscle layer width; lower fecal pH; and a higher relative abundance of Bacteroidota, while the SD+FS group showed the highest abundance of Actinobacteriota. The SD+GOPCMF group stood out for showing the lowest fecal pH, better a-diversity (Chao and Shannon index), and the highest width of the longitudinal muscle layer. Conclusion: pearl millet subjected to different processing has a good chemical-nutritional composition and beneficial effects on intestinal health, evidenced mainly by the improvement in the composition of the microbiota and intestinal morphology, on iron metabolism and in reduction of inflammation and oxidative stress in vivo. However, germinated pearl millet stands out for favoring the chemical-nutritional composition and beneficial effects on the body, both pre-cooked added to a normal diet or raw added to a high- fat diet. Keywords: open pan cooking; extrusion; germination; pre-cooked millet flours; intestinal microbiota; iron bioavailabilityOs milhetos, além de serem nutritivos, fornecendo carboidratos, proteínas, fibras alimentares, amido resistente e minerais com ferro, possuem baixo custo e têm potencial para serem ambientalmente sustentáveis e resistentes, sendo uma opção promissora para superar situações de insegurança alimentar e nutricional. No Brasil a espécie mais difundida é a Pennisetum glaucum. Seu grão apresenta boa composição química, no entanto, a presença de fitoquímicos, como fitatos, pode comprometer sua qualidade nutricional. Portanto, recomenda-se consumir o grão inteiro submetido a processamentos, como a germinação e a extrusão termoplástica, para preservar ou melhorar seu valor nutricional. Além disso, a inclusão desse cereal na dieta poderia minimizar alterações metabólicas no organismo, devido à sua boa biodisponibilidade de ferro, potencial efeito antioxidante, anti-inflamatório e melhora da saúde intestinal. Objetivo: avaliar a composição química-nutricional do milheto (Pennisetum glaucum (L.) R. Br.) submetido a diferentes processamentos e seus efeitos na saúde intestinal, metabolismo do ferro, estresse oxidativo e inflamação. Metodologia: este estudo foi dividido em três fases. Na primeira fase (ensaio biológico I, artigo 1), foram investigados os efeitos do consumo de milheto pérola germinado (farinha de milheto cru) na composição da microbiota e na morfologia intestinal de ratos alimentados com dieta rica em gordura saturada e frutose (HFHF). Para isso, os animais foram inicialmente divididos em dois grupos: AIN-93M e HFHF, por 8 semanas, para indução de alterações metabólicas. Posteriormente, os animais do grupo AIN-93M foram mantidos e o grupo HFHF foi dividido em HFHF (dieta HFHF) e HFHF + milheto (HFHF + farinha de milheto germinado) por 10 semanas. Na segunda fase (composição química-nutricional e biodisponibilidade de ferro in vitro, artigo 2), foi realizada a composição química-nutricional das farinhas de milheto pérola com diferentes processamentos: farinha de milheto não germinado cozido em panela aberta (NGOPCMF); farinha de milheto germinado cozido em panela aberta (GOPCMF) e farinha de milheto cozido por extrusão (ECMF), e suas respectivas biodisponibilidades de ferro in vitro, utilizando células Caco-2. Na terceira fase (ensaio biológico II, artigos 3 e 4), foram analisados os efeitos do consumo de milheto pérola submetido a diferentes processamentos (farinhas de milheto cozido) no metabolismo de ferro, na saúde intestinal, no estresse oxidativo e na inflamação em ratos induzidos à deficiência de ferro, por meio do método de depleção (animais recebendo dieta padrão isenta de ferro (SD iron-free) por 28 dias, para induzir a deficiência de ferro) e repleção de hemoglobina (animais separados em 4 grupos para tratamento: 1 grupo controle, que recebeu como fonte de ferro sulfato ferroso (SD+FS) e 3 grupos testes, que receberam farinha de milheto não germinado cozido em panela aberta (SD+ NGOPCMF), farinha de milheto germinado cozido em panela aberta (SD+ GOPCMF) ou farinha de milheto cozido por extrusão (SD+ ECMF), por 21 dias). Resultados: Artigo 1: A farinha de milheto pérola germinado cru reduziu o gênero Oscillibacter e o filo Desulfobacterota, enquanto aumentou a família Eggerthellaceae. Além disso, aumentou a diversidade beta, o peso do ceco, a relação ceco/peso corporal, a profundidade e espessura das criptas, a contagem de células caliciformes e a concentração do AGCC propionato e reduziu o pH fecal e a excreção urinária de manitol. Artigo 2: Em relação à composição química das farinhas de milheto pérola cozido, quando comparada à NGOPCMF, a ECMF apresentou aumento nos conteúdos de carboidratos, triptofano, ferro, manganês, ácidos graxos saturados totais, diosmina e cianidina e redução no total de fibra alimentar, amido resistente e ácidos graxos monoinsaturados e poli-insaturados totais. Por outro lado, a GOPCMF apresentou aumento no teor de lisina, ácidos graxos poli-insaturados totais e vitamina C e redução nos conteúdos de fitato, ácidos graxos saturados e monoinsaturados totais e riboflavina. Além disso, ambas as farinhas (GOPCMF e ECMF) demonstraram aumento nas concentrações de aminoácidos essenciais e não essenciais e redução nas concentrações de lipídios totais e vitamina E total. No ensaio in vitro, a concentração de ferritina foi maior nas células Caco-2 expostas GOPCMF e ECMF em comparação à NGOPCMF. Artigo 3: O grupo SD+GM apresentou aumento na expressão dos genes DcytB, ferroportina e hefaestina. O grupo SD+EM apresentou aumento na concentração de transferrina em comparação ao grupo SD+FS e de ferro sérico, em comparação aos demais grupos, e redução na capacidade antioxidante total (TAC) do fígado. No grupo SD+CM houve aumento na expressão de ferritina. Todos os grupos testes (SD+CM, SD+GM e SD+EM) demonstraram aumento na expressão gênica de DMT1 e hefaestina, bem como na concentração de ferro sérico e redução na expressão gênica de transferrina, Nrf2 e TNF e nos níveis de MDA, NO, SOD e CAT em relação ao grupo SD+FS. Artigo 4: Os animais alimentados com as farinhas de milheto pérola submetidas a diferentes processamentos (SD+NGOPCMF, SD+GOPCMF e SD+ECMF) demonstraram maior índice de Chao no microbioma e maior número e área de células caliciformes e largura da camada muscular longitudinal. Os grupos SD+NGOPCMF e SD+GOPCMF demonstraram maior peso do ceco, profundidade da cripta, espessura da cripta e largura da camada muscular circular; menor pH fecal; e maior abundância relativa de Bacteroidota, enquanto o grupo SD+FS apresentou a maior abundância de Actinobacteriota. O grupo SD+GOPCMF destacou-se por apresentar o menor pH fecal, melhor diversidade a (índice de Chao e Shannon) e maior largura da camada muscular longitudinal. Conclusão: o milheto pérola submetido a diferentes processamentos apresenta boa composição química-nutricional e efeitos benéficos na saúde intestinal, evidenciado principalmente pela melhora da composição da microbiota e da morfologia intestinal, no metabolismo do ferro e na redução da inflamação e do estresse oxidativo in vivo. Porém, o milheto pérola germinado se destaca por favorecer a composição químico-nutricional e os efeitos benéficos ao organismo, tanto pré-cozido adicionado a uma dieta normal quanto cru adicionado a uma dieta rica em gordura. Palavras-chave: cozimento em panela aberta; extrusão; germinação; farinhas de milheto pré-cozido; microbiota intestinal; biodisponibilidade de ferro