Produção e purificação do domínio de ligação ao receptor (RBD) wild type do SARS-CoV-2 em Escherichia coli BL21 (DE3)

Abstract

O SARS-CoV-2, agente etiológico da COVID-19, desencadeou uma pandemia de dimensões globais e estimulou o desenvolvimento de estudos voltados à caracterização de seus componentes estruturais, entre eles o Domínio de Ligação ao Receptor (RBD) da proteína Spike. O RBD desempenha papel central na interação com o receptor ACE2 e constitui um alvo prioritário em pesquisas diagnósticas, imunológicas e biotecnológicas. Nesse contexto, a produção heteróloga de proteínas em sistemas bacterianos representa uma estratégia eficiente, econômica e amplamente empregada na obtenção de antígenos virais, destacando-se a Escherichia coli BL21 (DE3) como um dos hospedeiros mais utilizados devido ao seu rápido crescimento, baixo custo e capacidade elevada de expressão recombinante. Este trabalho teve como objetivo produzir o RBD wild type do SARS-CoV-2 utilizando o sistema E. coli BL21 (DE3)/pET-28a, confirmando sua expressão por meio de SDS-PAGE e Western blotting. Inicialmente, a transformação da E. coli com o plasmídeo pET-28a contendo a sequência codificadora do RBD foi confirmada por PCR e eletroforese em gel de agarose, com amplificação específica de um fragmento de aproximadamente 300 pb e ausência de bandas no controle negativo, assegurando a integridade da construção gênica. Após a confirmação, procedeu-se à indução da expressão utilizando IPTG, seguida pelas etapas de lise celular, obtenção da fração solúvel e purificação por resina de afinidade para proteínas contendo cauda de histidina. A análise em SDS-PAGE revelou uma banda na altura de 25 kDa, compatível com o peso molecular esperado para o RBD. A identidade da proteína foi confirmada por dois ensaios de Western blotting: o primeiro utilizando anticorpo anti-His, que reconheceu especificamente a cauda de histidina adicionada ao RBD; e o segundo empregando anticorpos presentes no soro de pacientes infectados pelo SARS-CoV-2, demonstrando que o RBD recombinante manteve epítopos reconhecíveis pelo sistema imune humano. Os resultados demonstram que o sistema E. coli BL21 (DE3)/pET-28a foi eficiente na produção do RBD recombinante, garantindo não apenas a expressão da proteína, mas também sua integridade estrutural mínima para reconhecimento imunológico. Dessa forma, o estudo evidencia que a plataforma utilizada é adequada para a obtenção do RBD, constituindo uma alternativa viável para estudos sorológicos, aplicações diagnósticas e futuras investigações em biotecnologia voltadas ao entendimento e monitoramento de coronavírus. Palavras-chave: SARS-CoV-2; RBD; produção heteróloga; Escherichia coli BL21 (DE3).SARS-CoV-2, the etiological agent of COVID-19, triggered a global pandemic and stimulated the development of studies focused on characterizing its structural components, including the Receptor-Binding Domain (RBD) of the Spike protein. The RBD plays a central role in the interaction with the ACE2 receptor and is a priority target in diagnostic, immunological, and biotechnological research. In this context, heterologous protein production in bacterial systems represents an efficient, economical, and widely used strategy for obtaining viral antigens, with Escherichia coli BL21 (DE3) standing out as one of the most used hosts due to its rapid growth, low cost, and high recombinant expression capacity. This work aimed to produce the wild-type RBD of SARS-CoV-2 using the E. coli BL21 (DE3)/pET-28a system, confirming its expression through SDS-PAGE and Western blotting. Initially, the transformation of E. coli with the pET-28a plasmid containing the RBD coding sequence was confirmed by PCR and agarose gel electrophoresis, with specific amplification of a fragment of approximately 300 bp and absence of bands in the negative control, ensuring the integrity of the gene construct. After confirmation, expression was induced using IPTG, followed by cell lysis, obtaining the soluble fraction, and purification by affinity resin for proteins containing histidine tails. SDS- PAGE analysis revealed a band at a height of 25 kDa, consistent with the expected molecular weight for the RBD. The protein's identity was confirmed by two Western blotting assays: the first using anti-His antibody, which specifically recognized the histidine tail added to the RBD; and the second employing antibodies present in the serum of patients infected with SARS-CoV-2, demonstrating that the bacterial RBD retained epitopes recognizable by the human immune system. The results demonstrate that the E. coli BL21 (DE3)/pET-28a system was efficient in producing recombinant RBD, ensuring not only protein expression but also its minimum structural integrity for immunological recognition. Thus, the study shows that the platform used is suitable for obtaining RBDconstituting a viable alternative for serological studies, diagnostic applications, and future biotechnology investigations aimed at understanding and monitoring coronaviruses. Keywords: SARS-CoV-2; RBD; heterologous production; Escherichia coli BL21 (DE3)