Phenotypic and genetic characterization of Escherichia coli isolated from clinically healthy swine and the role of plasmids and extracellular vesicles in the dissemination and reservoir of antimicrobial resistance genes
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Universidade Federal de Viçosa
Abstract
Antibiotic resistance is a global public health problem, and its association with reservoirs of antimicrobial resistance (AMR) genes in non-human sources, such as farm animals, including pigs, has raised concerns and highlighted the urgent need for monitoring. Mobile genetic elements, including plasmids, carrying different AMR genes have been reported in bacteria from pigs, in both sick and healthy animals. Therefore, studies focusing on clinically healthy animals are essential, as they can provide important information that improve actions to control antimicrobial resistance. In addition, it is crucial to understand the mechanisms involved in the spread of AMR genes in food-production animals. In this context, the present study aimed to characterize bacterial isolates of the Enterobacteriaceae family from clinically healthy pigs; evaluate the profile of antimicrobial susceptibility and AMR genes; investigate plasmids associated with AMR resistance; and investigate the participation of extracellular vesicles produced by multidrug-resistant (MDR) bacterial isolates as reservoirs of AMR genes. From the bacterial collection of 28 isolates, 96.4% (n = 27) were identified as belonging to the Escherichia coli species. All isolates were considered multidrug-resistant with multiple AMR genes. Horizontal transfer of the blaCTX-M gene to the recipient strain E. coli J53 was confirmed for nine MDR- E. coli isolates by conjugation assay, using ceftiofur as the selective agent. The ß-lactam resistance profile was confirmed in the transconjugants, in addition to the presence of the gene. Furthermore, three representative isolates were subsequently selected for genome sequencing and in silico characterization. As a result, consistent with their phenotypic profiles, these strains harbored multiple AMR genes and plasmid replicons belonging to different incompatibility groups (Inc). In silico analyses identified two hypothetical plasmids carrying the blaCTX-M gene and another carrying the blaTEM gene, all were conjugative and carrying additional AMR genes. To characterize the extracellular vesicles (EVs) produced by the selected bacteria, these were obtained by ultracentrifugation from the culture of isolates with and without ceftiofur and tetracycline as stress agents. As a result, treatment with tetracycline resulted in an increase in both the diameter and number of EVs compared to the control group. However, the EVs obtained from the control and ceftiofur groups carried a higher number of AMR genes, including the blaCTX-M 2, blaTEM, tetA, and tetB genes. These results demonstrate that EVs are capable of packaging and potentially spreading AMR genes even in the absence of antibiotics, suggesting that this mechanism may contribute to the spread of genes in the environment and in hosts. In conclusion, our results reveal that clinically healthy animals, regardless of the use of diets without antimicrobial additives, carry AMR genes of importance in animal and human clinical practice. They highlight the importance of investigating clinically healthy animals as reservoirs of AMR genes and reinforce the need for future studies focusing on EVs derived from MDR- E. coli of animal origin to better understand their contribution to the spread of antibiotic resistance in livestock. Keywords: horizontal multirresistance; one gene transfer; health vesiculation; food-producing animals
A resistência a antibióticos é um problema de saúde pública global e a associação a reservatórios de genes de resistência a antimicrobianos (AMR) em fontes não humanas, como animais de produção, como suínos, tem despertado preocupação e a necessidade urgente de monitoramento. Os elementos genéticos móveis, incluindo plasmídeos, carregando diferentes genes AMR têm sido relatados em bactérias provenientes de suínos, em ambos animais doentes e saudáveis. Portanto, estudos com ênfase em animais clinicamente saudáveis são essenciais, visto que podem fornecer informações importantes que nortearão ações para controle de resistência a antimicrobianos. Além disso, é crucial compreender os mecanismos envolvidos na disseminação de genes AMR em animais de produção. Nesse contexto, o presente estudo teve como objetivo caracterizar isolados bacterianos da família Enterobacteriaceae a partir de suínos clinicamente saudáveis; avaliar o perfil de susceptibilidade a antimicrobianos e de genes AMR; investigar os plasmídeos associados à resistência a AMR e investigar a participação de vesículas extracelulares produzidas por isolados bacterianos MDR como reservatórios de genes AMR. Os isolados clínicos investigados foram obtidos a partir de animais em fase terminal de produção sem sinais clínicos de qualquer doença, com dietas com e sem adição de promotor de crescimento, sendo um total de 28. Destes, 96,4% (n = 27) foram identificados como Escherichia coli. Todos os isolados (28) foram considerados multidroga resistente com vários genes AMR. A transferência horizontal do gene blaCTX-M para a linhagem receptora E. coli J53 foi confirmada para nove isolados de E. coli MDR por ensaio de conjugação, usando ceftiofur como agente seletivo. O perfil de resistência aos beta-lactâmicos foi confirmado nos transconjugantes, além da presença do gene. Além disso, três isolados representativos foram subsequentemente selecionados para sequenciamento do genoma e caracterização in silico. Como resultado, consistente com seus perfis fenotípicos, essas linhagens abrigavam vários genes AMR e plasmídeos pertencentes a diferentes grupos de incompatibilidade (Inc). As análises in silico permitiram identificar dois plasmídeos, um deles carregando o gene blaCTX-M e outro carregando ogene blaTEM, os dois caracterizados como conjugativos, contendo região tra típica, além de carrear outros genes AMR relevantes e de interesse clínico. Para a caracterização das vesículas extracelulares (VEs) produzidas pelas bactérias selecionadas, estas foram obtidas por ultracentrifugação a partir do cultivo dos isolados com e sem ceftiofur e tetraciclina, como agentes estressores. Como resultado, o tratamento com tetraciclina resultou em um aumento tanto no diâmetro quanto no número de VEs em comparação com o grupo controle. No entanto, as VEs obtidas dos grupos controle e ceftiofur apresentaram os mesmos marcadores de genes AMR, incluindo os genes blaCTX-M-2, blaTEM, tetA e tetB. Esses resultados demonstram que as VEs são capazes de transportar e potencialmente disseminar genes AMR mesmo na ausência de antibiótico, sugerindo que esse mecanismo pode contribuir para a disseminação de genes no ambiente e em hospedeiros. Em conclusão, nossos resultados revelam que animais clinicamente saudáveis, independente do uso de dietas sem adição de aditivos antimicrobianos, carreiam genes AMR de importância na prática clínica animal e humana e destacam a importância de se investigar animais clinicamente saudáveis como reservatórios de genes AMR e reforçam a necessidade de estudos futuros com foco em VEs derivadas de E. coli MDR de origem animal para melhor compreensão da sua contribuição na disseminação da resistência aos antibióticos na pecuária Palavras-chave: transferência horizontal de genes; vesiculação; animais de produção; multirresistência; saúde única
A resistência a antibióticos é um problema de saúde pública global e a associação a reservatórios de genes de resistência a antimicrobianos (AMR) em fontes não humanas, como animais de produção, como suínos, tem despertado preocupação e a necessidade urgente de monitoramento. Os elementos genéticos móveis, incluindo plasmídeos, carregando diferentes genes AMR têm sido relatados em bactérias provenientes de suínos, em ambos animais doentes e saudáveis. Portanto, estudos com ênfase em animais clinicamente saudáveis são essenciais, visto que podem fornecer informações importantes que nortearão ações para controle de resistência a antimicrobianos. Além disso, é crucial compreender os mecanismos envolvidos na disseminação de genes AMR em animais de produção. Nesse contexto, o presente estudo teve como objetivo caracterizar isolados bacterianos da família Enterobacteriaceae a partir de suínos clinicamente saudáveis; avaliar o perfil de susceptibilidade a antimicrobianos e de genes AMR; investigar os plasmídeos associados à resistência a AMR e investigar a participação de vesículas extracelulares produzidas por isolados bacterianos MDR como reservatórios de genes AMR. Os isolados clínicos investigados foram obtidos a partir de animais em fase terminal de produção sem sinais clínicos de qualquer doença, com dietas com e sem adição de promotor de crescimento, sendo um total de 28. Destes, 96,4% (n = 27) foram identificados como Escherichia coli. Todos os isolados (28) foram considerados multidroga resistente com vários genes AMR. A transferência horizontal do gene blaCTX-M para a linhagem receptora E. coli J53 foi confirmada para nove isolados de E. coli MDR por ensaio de conjugação, usando ceftiofur como agente seletivo. O perfil de resistência aos beta-lactâmicos foi confirmado nos transconjugantes, além da presença do gene. Além disso, três isolados representativos foram subsequentemente selecionados para sequenciamento do genoma e caracterização in silico. Como resultado, consistente com seus perfis fenotípicos, essas linhagens abrigavam vários genes AMR e plasmídeos pertencentes a diferentes grupos de incompatibilidade (Inc). As análises in silico permitiram identificar dois plasmídeos, um deles carregando o gene blaCTX-M e outro carregando ogene blaTEM, os dois caracterizados como conjugativos, contendo região tra típica, além de carrear outros genes AMR relevantes e de interesse clínico. Para a caracterização das vesículas extracelulares (VEs) produzidas pelas bactérias selecionadas, estas foram obtidas por ultracentrifugação a partir do cultivo dos isolados com e sem ceftiofur e tetraciclina, como agentes estressores. Como resultado, o tratamento com tetraciclina resultou em um aumento tanto no diâmetro quanto no número de VEs em comparação com o grupo controle. No entanto, as VEs obtidas dos grupos controle e ceftiofur apresentaram os mesmos marcadores de genes AMR, incluindo os genes blaCTX-M-2, blaTEM, tetA e tetB. Esses resultados demonstram que as VEs são capazes de transportar e potencialmente disseminar genes AMR mesmo na ausência de antibiótico, sugerindo que esse mecanismo pode contribuir para a disseminação de genes no ambiente e em hospedeiros. Em conclusão, nossos resultados revelam que animais clinicamente saudáveis, independente do uso de dietas sem adição de aditivos antimicrobianos, carreiam genes AMR de importância na prática clínica animal e humana e destacam a importância de se investigar animais clinicamente saudáveis como reservatórios de genes AMR e reforçam a necessidade de estudos futuros com foco em VEs derivadas de E. coli MDR de origem animal para melhor compreensão da sua contribuição na disseminação da resistência aos antibióticos na pecuária Palavras-chave: transferência horizontal de genes; vesiculação; animais de produção; multirresistência; saúde única
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OLIVEIRA, Rúzivia Pimentel. Phenotypic and genetic characterization of Escherichia coli isolated from clinically healthy swine and the role of plasmids and extracellular vesicles in the dissemination and reservoir of antimicrobial resistance genes. 2025.110 f. Tese (Doutorado em Microbiologia Agrícola) - Universidade Federal de Viçosa, Viçosa. 2025.