Adaptação das metodologias de PRINS, micromanipulação e DOP-PCR para construção de sonda da região sub-centromérica do cromossomo-X

Abstract

Com o advento da hibridização in situ fluorescente, a citogenética foi introduzida na era molecular, com avanços metodológicos que possibilitaram a investigação em vários níveis da ciência dos cromossomos. Destaca-se entre esses avanços a identificação de pares de cromossomos homólogos de forma inequívoca, a localização de sequências específicas, a prospecção direta de anormalidades cromossômicas, além de proporcionar informações de alta-resolução sobre a estrutura e organização dos cromossomos. Dentro das estratégias da citogenética molecular, as técnicas de microdissecção e de DOP-PCR têm sido muito utilizadas na construção de sondas cromossomo-específicas. Entretanto, a ausência de protocolos bem estabelecidos e reprodutíveis, além da necessidade de captura por micromanipulação de um número relativamente grande de cromossomos, essa técnica tem sido limitada quanto à sua aplicação mais ampla. O presente trabalho teve como objetivo padronizar uma metodologia para construção de sondas cromossomo-específicas, associando as técnicas de micromanipulação e DOP-PCR. Culturas de linfócitos humanos foram realizadas para a obtenção de lâminas contendo metáfases, tanto de origem masculina quanto feminina. A reação de amplificação in situ (PRINS) foi realizada sobre uma lâmina contendo metáfases, aplicando uma mistura de 50 μl de reação, contendo 1,0 U de Platinun® Taq DNA Polymerase High Fidelity, tampão de reação da enzima, 2 mM de MgSO4, 200 μM de dNTPs e 4 μM de primer. Em seguida, dez fragmentos de cromossomos X foram microdissectados utilizando microagulhas acopladas a um microscópio de contraste de fase e transferidos para um tubo de 0,2mL contendo proteinase K, de onde seguiu para a desproteinização a 37 ºC por 24 horas. O material foi amplificado por DOP-PCR em 15 μl de reação, e marcado com Tetramethyl-rhodamine-5-dUTP. A sonda foi desnaturada por 10 minutos a 99 ºC em 35 μL de uma mistura de hibridização contendo: 50 % Formamida, 2X SSC, 10 % Dextran Sulfato, 1 μg de Cot-1 e 200 ng da sonda marcada. Essa mistura foi aplicada na lâmina, que foi desnatura a 75 ºC por 8 minutos e depois foi submetida à hibridização a 37 ºC por 20 horas. Após a hibridização, foram realizadas as lavagens de estringência, contra-coloração com DAPI, e visualização do material em microscópio de fluorescência acoplado a um sistema de captura de imagens. Uma sonda específica para a região subcentromérica do cromossomo X foi obtida, apresentando uma marcação em metáfases de indivíduos masculinos e duas marcações em metáfases de indivíduos femininos, além de um ou dois sinais fluorescentes nos núcleos interfásicos.

The fluorescente in situ hybridization advent introducted the cytogenetics in molecular era, with methodological advances that enable the investigation of chromosome science at different levels. Among these advances, it stands out the unequivocally identification of homologous chromosomes pairs, the specific sequences location, the direct prospecting of chromosomal abnormalities, besides providing high-resolution information on the structure and organization of chromosomes. Within the strategies of molecular cytogenetics, microdissection and DOP-PCR techniques have been widely used in the chromosome-specific probes construction. However, the absence of well-established and reproducible protocols, besides the need for relatively large number of chromosomes for micromanipulation, this technique has been limited. The present study aimed to standard a methodology for chromosome-specific probes construction, involving micromanipulation and DOP-PCR techniques. Human lymphocyte cultures were carried out to obtain metaphases, both male and female origin. In situ amplification (PRINS) reaction was performed on a slide containing metaphase, applying 50 μL of reaction mix with Platinun® Taq DNA Polymerase High Fidelity 1 U, enzime reaction buffer, MgSO4 2 mM, dNTPs 200 μM and primer 4 μM. Then, ten X chromosomes fragments were microdissected using microneedles coupled to a phase contrast microscope and transferred to a tube containing 0.2 μL proteinase K, where deproteinizated at 37 °C for 24 hours. The material was amplified by DOP-PCR in 15 μL of reaction, and marked with Tetramethyl-rhodamine-5-dUTP. The probe was denatured for 10 minutes at 99 °C in 35 μL of hybridization mix containing: formamide 50 %, SSC 2X, Dextran Sulfate 10 %, 1 mg of Cot-1 and 200 ng of labeled probe. This mix was applied on the slide, which was denatured at 75 ºC for 8 minutes and then subjected to hybridization at 37 °C for 20 hours. After hybridization, stringency washes and counter-staining with DAPI were performed, and the material was analyzed with a fluorescence microscope coupled to an image capture system. A subcentromeric X chromosome specific probe was obtained, with an unique mark in male metaphase and two marks in female metaphases, with one or two fluorescent signals in interphase nuclei.