Seleção de linhagens evoluídas de Papiliotrema laurentii com maior taxa de consumo de glicerol por evolução adaptativa de laboratório

Abstract

Os combustíveis fósseis ainda são amplamente utilizados para suprir a crescente demanda energética contribuindo para a emissão de gases do efeito estufa. Sendo assim, é fundamental reduzir a comercialização desses combustíveis no intuito de mitigar os seus impactos negativos e intensificar esforços para ampliar a produção de biocombustíveis. O biodiesel, uma mistura de ésteres metílicos de ácidos graxos, é uma alternativa ao diesel de petróleo. Este biocombustível é produzido a partir da transesterificação de óleos, principalmente de origem vegetal, gerando glicerol como subproduto. Entretanto, a produção de óleo vegetal requer o emprego de terras cultiváveis, recursos hídricos e fertilizantes e, portanto, compete com a produção de alimentos. O biodiesel de terceira geração (3G) pode ser produzido a partir de óleo de leveduras oleaginosas. A utilização do subproduto glicerol para produção de óleo microbiano é uma alternativa promissora para estimular a produção de biodiesel 3G. A linhagem Papiliotrema laurentii UFV-1 é capaz de produzir altos teores de lipídios em meios de cultivo contendo glicose, xilose e lactose; todavia, ela não assimila eficientemente glicerol como fonte de carbono. Portanto, esse trabalho objetivou a seleção de linhagens de P. laurentii UFV-1 por evolução adaptativa em laboratório (Adaptive laboratory evolution - ALE) com maior captação de glicerol visando a produção de lipídios. Além disso, foi realizada a caracterização fisiológica das linhagens por meio da avaliação do crescimento em diferentes concentrações de glicerol e inibidores presentes na glicerina bruta, bem como a análise do fenótipo oleaginoso. A ALE foi utilizada como estratégia em duas fases, a primeira com transferências sucessivas de cultura de P. laurentii em meio SS2 modificado com glicerol e extrato de leveduras por 102 dias, e a segunda com transferências em meio mínimo YNB contendo glicerol como única fonte de carbono e energia por 48 dias. Após 102 dias, as linhagens evoluídas ALE-1, ALE-2 e ALE-3 apresentaram valores de velocidades específicas de crescimento em meio SS2 de 0,19 ± 0,00; 0,26 ± 0,01 e 0,22 ± 0,02 (h-1), respectivamente, superiores ao da parental [0,16 ± 0,01 (h-1)]. Com 150 dias de cultivo, os valores de velocidade de crescimento foram maiores do que em 102 dias, 0,28 ± 0,00; 0,25 ± 0,02 e 0,29 ± 0,01 (h-1) para ALE-1, ALE-2 e ALE-3, respectivamente. As linhagens evoluídas por 150 dias apresentaram consumo de aproximadamente 65 e 70% de glicerol após 5 e 7 dias, respectivamente. Também houve um aumento na produção de biomassa, principalmente para a linhagem ALE-2 (150 dias). Portanto, a estratégia de ALE em duas fases adotada neste trabalho levou ao aumento da capacidade de crescimento em glicerol das linhagens evoluídas. O perfil de crescimento das linhagens evoluídas em diferentes concentrações de glicerol foi similar. Na presença de metanol, observou-se um aumento do período da fase lag. Em geral, o efeito inibitório do cloreto de sódio foi o mais evidente a partir da concentração de 20 g/L. O fenótipo oleaginoso foi avaliado em meios de cultivo SS2 contendo glicerol e glicose como fontes de carbono, com a razão C/N de 100/1. Nos cultivos em SS2 modificado com 30 g/L de glicerol, ALE-2 apresentou um maior rendimento de biomassa. Contudo, as linhagens evoluídas não apresentaram o fenótipo oleaginoso em glicerol e glicose, indicando que o aumento da capacidade de assimilação de glicerol foi acompanhado por um importante trade-off. Portanto, a ALE levou a mudanças no metabolismo de carbono das linhagens evoluídas que resultaram na perda do fenótipo oleaginoso. Dentre as linhagens evoluídas, a ALE-2 apresentou os maiores parâmetros de produção de lipídios. Palavras-chave: metabolismo de glicerol; leveduras oleaginosas; biodiesel.

Fossil fuels are still widely used due to the growing energy demand, contributing to greenhouse gas emissions. Therefore, it is pivotal to reduce the commercialization of these fuels in order to mitigate their negative impacts and strengthen efforts to increase the production of biofuels. Biodiesel, an alternative to petroleum diesel, is a mixture of fatty acid methyl esters produced from the transesterification of oils, mainly vegetable oils. During its production, glycerol is generated as a byproduct. However, the production of vegetable oil requires the use of arable land, water resources and fertilizers, which can compete with food production. Third-generation biodiesel (3G) can be produced from oleaginous yeast oil. The use of crude glycerol for the production of microbial oil is a promising alternative to boost the production of 3G biodiesel. Papiliotrema laurentii UFV-1 is capable of producing high lipids contents in culture media containing glucose, xylose and lactose; however, it does not efficiently assimilate glycerol as the sole carbon source. Therefore, this study aimed to select P. laurentii UFV-1 strains by adaptive laboratory evolution (ALE) with improved glycerol uptake aiming at lipid production. Additionally, the physiological characterization of the evolved strains was performed through evaluation of growth in different concentrations of glycerol and inhibitors present in the crude glycerol, as well as the analysis of oleaginous phenotype. The ALE was conducted in two phases, the first one with successive transfers of P. laurentii culture in SS2 medium modified with glycerol and yeast extract for 102 days, and the second one with transfers in YNB minimal medium containing glycerol as the sole carbon and energy source for 48 days. After 102 days, the evolved strains ALE-1, ALE-2 and ALE-3 exhibited specific growth rates in SS2 medium of 0.19 ± 0.00; 0.26 ± 0.01 and 0.22 ± 0.02 (h-1) respectively, which are higher than that of the parental [0.16 ± 0.01 (h-1)]. After 150 days of culture, the growth values were higher than in 102 days, 0.28 ± 0.00; 0.25 ± 0.02 and 0.29 ± 0.01 (h-1) for ALE-1, ALE-2 and ALE-3, respectively. The evolved strains (150 days) displayed consumption of about 65 and 70% of glycerol after 5 e 7 days, respectively. There was also an increase in biomass production, mainly for the ALE-2 (150 days). Therefore, the ALE strategy in two phases led to the increase of the growth capacity in glycerol in the evolved strains. The growth pattern of the evolved strains in different glycerol concentrations was similar. In the presence of methanol, it was observed an increase in the lag phase period. Overall, the inhibitory effect of sodium chloride was more pronounced from concentration of 20 g/L. The oleaginous phenotype was evaluated in SS2 culture media containing glycerol and glucose as carbon sources, with the C/N ratio of 100/1. In cultures with SS2 modified with 30 g/L glycerol, the evolved strains consumed approximately 70% of glycerol and ALE-2 showed a higher biomass yield. However, the evolved strains did not present oleaginous phenotype in glycerol and glucose, indicating that the increase of glycerol assimilation capacity took place along with an important trade-off. Thus, the ALE caused alterations in carbon metabolism of the evolved strains that led to the loss of the oleaginous phenotype. Among the evolved strains, the ALE-2 displayed the highest lipid production parameters. Keywords: glycerol metabolism; oleaginous yeast; biodiesel.