Leishmania infantum chagasi: estudo da atividade enzimática de uma Nucleotídeo Trifosfato Difosfohidrolase-2 (NTPDase-2) e clonagem de uma possível Serine/Arginine Protein Kinase (SRPK).

Abstract

A leishmaniose é uma doença causada por protozoários do gênero leishmania sendo transmitidas por flebotomíneos. A doença pode se manifestar com lesões na pele e mucosas do indivíduo infectado ou pode atingir órgãos internos (leishmaniose visceral). A Leishmania infantum chagasi é um dos protozoários causadores de leishmaniose visceral com importante manifestação no Brasil. Neste contexto, o estudo de enzimas quinases como alvos de ação de medicamentos proporciona meios racionais para a pesquisa de novas drogas. Neste trabalho foram estudadas duas enzimas, uma apirase, NTPDase-2 e uma quinase SRPK de L. infantum chagasi. O objetivo deste estudo é padronizar a renaturação da LicNTPDase-2 e avaliar a atividade da enzima frente a diferentes nucleotídeos (ADP, UDP, GDP e ATP), verificar melhor atividade frente a diferentes pHs, temperaturas de 25ºC e 37ºC e verificar variações de sua estabilidade utilizando thermal shift. Também foi realizada a clonagem da SRPK de Leihsmania infantum chagasi para a realização de estudos bioquímicos e biológicos. Assim, neste estudo foi possível identificar que os tampões de 3, 4, 5 e 6 apresentaram melhora atividade enzimática, comparado com os tampões 1, 2 e 7, após 24 horas de renaturação de 2 ºC a 8 ºC. Dentre os tampões o tampão 4 apresentou o maior shift. Não ocorreu diferença significativa nos testes realizados a 25ºC e a 37ºC, assim como no teste para avalição de pH. Para as análises de nucleotídeos o UDP, GDP e ADP apresentaram melhora na atividade quando comparados com o ATP. Foi possível realizar a clonagem de LicSRPK predita nas análises de bioinformática em Leishmania infantum chagasi, sendo importante agora a realização de sequenciamento e ampliação de seus estudos.

Leishmaniasis is a disease caused by protozoa of the genus Leishmania wich are transmitted by sandflies. The disease can manifest with lesions on the skin and mucous membranes of the infected individual or can reach internal organs (visceral leishmaniasis). Leishmania infantum chagasi causes the visceral form of leishmaniasis with important manifestation in Brazil. In this context, the study of kinase enzymes as chemotherapic targets provides rational means for the research of new drugs. In this work two enzymes from L. infantum chagasi were studied: the NTPDase-2, an apyrase, and a SRPK kinase. The objective of this study is to standardize the renaturation of LicNTPDase-2 and to evaluate the activity of this enzyme against different nucleotides (ADP, UDP, GDP and ATP) in order to verify optimal activity against different pHs, temperatures of 25ºC and 37ºC and to evaluate variations on folding stability using thermal shift assay. The SRPK of Leihsmania infantum chagasi was also cloned to perform biochemical and biological studies. Thus, in this study it was possible to observe that buffers 3, 4, 5 and 6 allowed improved enzymatic activity, compared to buffers 1, 2 and 7, after 24 hours of renaturation of 2 ° C to 8 ° C. Among all tested buffers, the buffer 4 presented the largest folding shift. There was no significant difference in the tests performed at 25ºC and at 37ºC, as well as in pH variations. Regarding the nucleotide analyzes, UDP, GDP and ADP showed an improvement in the activity when compared to the ATP. It was possible to perform the cloning of predicted LicSRPK by bioinformatics analysis in Leishmania infantum chagasi, and it is now important to carry out the sequencing and amplification of its studies.