Bioprospection and adaptive mechanisms of halotolerant bacteria: applications in biotechnology and astrobiological studies

Abstract

Halophilic and halotolerant bacteria can be applied in environments where conventional organisms cannot thrive, such as in the bioremediation of salinized soils or the treatment of saline effluents. These organisms are also frequently used in astrobiology studies due to their well-recognized ability to tolerate or adapt to extreme conditions. Brazil, with its diverse biomes and high biodiversity, harbors saline environments that remain largely unexplored in terms of microbial biodiversity. This study aimed to investigate the biotechnological potential and the feasibility of using halotolerant bacteria isolated from extreme Brazilian environments (arid and saline) as model organisms in astrobiological studies, as well as to expand the understanding of the adaptive capacity of halotolerant microorganisms to NaCl. The bacteria were collected from three areas in Camocim, Ceará, Brazil. Their identification was carried out through fatty acid methyl ester (FAME) profiling and the analysis of the DNA sequence encoding the 16S rRNA. The requirement for or tolerance to NaCl and sodium perchlorate (NaClO4) were evaluated by determining the specific growth rates (µ) in culture media containing different salt concentrations. The ability to use NaClO4 as a final electron acceptor was also assessed. The biotechnological potential of the isolates was evaluated by analyzing their production of biosurfactants, exopolysaccharides, and the enzymes lipase, protease, and amylase. To study the adaptive capacity of microorganisms to sodium chloride concentrations above the maximum originally tolerated by the wild-type strain, the technique of adaptive laboratory evolution (ALE) was applied. The study used one of the isolates collected in Camocim, selected based on its µ value at 100 g L-1 of NaCl, and a bacterium previously isolated from Trindade Island, Brazil, which had demonstrated high adaptability to NaCl. The evolved and parental/wild-type strains were compared using growth curves and specific growth rate values at different NaCl concentrations. Additionally, it was assessed whether the mutations generated by ALE altered the growth rate in the presence of NaClO4 as a stressor and whether they affected the fatty acid profile in response to NaCl concentration in the growth medium. Among the isolates, those belonging to the genus Bacillus were predominant (18/20). All isolates were able to grow at 100 g L-1 NaCl and at least 30 g L-1 NaClO4, in addition to being able to reduce NaClO4 in the absence of other electron acceptors. The isolates could produce biosurfactants, exopolysaccharides, and enzymes of industrial/biotechnological interest. ALE resulted in variants with a higher specific growth rate and greater tolerance to higher NaCl concentrations compared to the parental strains. Furthermore, an increase in µ at 70 g L-1 NaClO4 was observed, along with changes in the fatty acid profile under both saline and non-saline stress conditions. Keywords: extremophiles; astrobiology; salt adaptation; adaptive laboratory evolution.

Bactérias halofílicas e halotolerantes podem ser aplicadas em áreas onde organismos convencionais não conseguem atuar, como por exemplo na biorremediação de solos salinizados ou no tratamento de efluentes salinos. Esses organismos são também utilizados com frequência em estudos de astrobiologia, dada a sua reconhecida capacidade de tolerar ou adaptar-se a condições extremas. O Brasil, com sua diversidade de biomas e elevada biodiversidade, abriga ambientes salinos pouco explorados no que concerne à biodiversidade microbiana. Este trabalho teve como principais objetivos estudar o potencial biotecnológico e a possibilidade de se utilizarem bactérias halotolerantes isoladas de ambientes extremos brasileiros (áridos e salinos) como organismos-modelo em estudos astrobiológicos, bem como ampliar o entendimento da capacidade de adaptação de microrganismos halotolerantes ao NaCl. As bactérias foram coletadas em 3 áreas de Camocim, Ceará, Brasil. Sua identificação foi feita por meio da análise dos perfis de ésteres metílicos de ácidos graxos (FAME) e pela análise da sequência de DNA que codifica para o rRNA 16S. A exigência de ou tolerância ao NaCl e ao perclorato de sódio (NaClO4) foram avaliadas por meio da determinação das taxas específicas de crescimento (µ) em meios de cultura contendo diferentes concentrações dos sais. Também foi avaliada a capacidade de utilização do NaClO4 como aceptor final de elétrons. O potencial biotecnológico dos isolados foi avaliado a partir da análise da produção de biossurfactantes, exopolissacarídeos e das enzimas lipase, protease e amilase. Para estudar a capacidade de adaptação dos microrganismos a concentrações de cloreto de sódio acima da máxima tolerada originalmente pela linhagem selvagem, foi utilizada a técnica de evolução adaptativa em laboratório (EAL). Utilizou-se no estudo um dos isolados coletados em Camocim, selecionado com base no valor de µ a 100 g L-1 de NaCl, e uma bactéria isolada em trabalhos anteriores na Ilha da Trindade, Brasil, que demonstrou alta adaptabilidade ao NaCl. As linhagens evoluídas e parentais/selvagens foram comparadas por meio de curvas de crescimento e pelos valores de taxa específica de crescimento em diferentes concentrações de NaCl. Adicionalmente, avaliou-se se as mutações geradas pela EAL alteraram a taxa de crescimento na presença de NaClO4 como agente estressor e o perfil de ácidos graxos em resposta à concentração de NaCl no meio de crescimento. Dentre os isolados, predominaram aquelas pertencentes ao gênero Bacillus (18/20). Todos os isolados cresceram em 100 g L-1 de NaCl e em pelo menos 30 g L-1 de NaClO4, além de serem capazes de reduzir NaClO4 na ausência de outros aceptores de elétrons. Os isolados foram capazes de produzir biossurfactantes, exopolissacarídeos e enzimas de interesse industrial/biotecnológico. A EAL resultou na obtenção de variantes que apresentaram maior taxa de crescimento específico e tolerância a maiores concentrações de NaCl comparativamente às linhagens parentais. Observou-se ainda aumento de µ a 70 g L-1 de NaClO4 e alterações no perfil de ácidos graxos com e sem estresse salino. Palavras-chave: extremófilos; astrobiologia; adaptação a sal; evolução adaptativa em laboratório.