Análise de resposta imune de planta induzida por vesículas extracelulares de Ralstonia pseudosolanacearum

Abstract

O Complexo de Espécies Ralstonia solanacearum (CERS) é composto por bactérias Gram-negativas fitopatogênicas, causadoras da murcha bacteriana, de grande importância no setor agrícola. Esse complexo é formado por três espécies (R. solanacearum, R. pseudosolanacearum e R. syzygii), classificadas em quatro filotipos distribuídos em diferentes regiões geográficas no mundo. A alta diversidade genética, combinada com ampla gama de hospedeiros e alta taxa de sobrevivência da bactéria na ausência de uma planta hospedeira torna a doença de difícil controle. Neste contexto, a utilização de bacteriófagos tem se mostrado uma estratégia promissora para o controle da murcha bacteriana causada pelas bactérias do CERS. Os vírus que infectam bactérias podem se multiplicar de várias maneiras, resultando em diferentes consequências para o hospedeiro, desde a lise celular até infecções crônicas. As infecções crônicas, por sua vez, podem induzir alterações fenotípicas significativas no hospedeiro, afetando características como patogenicidade, crescimento, formação de biofilme entre outras. Vírus classificados na família Inoviridae são vírus que infectam bactérias de forma crônica, e, como consequência desta estratégia de multiplicação, causam diversas modificações fenotípicas nas células infectadas, incluindo alteração da agressividade em bactérias patogênicas. Uma das alterações já descritas é afetar a produção e composição das vesículas extracelulares bacterianas (VEBs). VEBs são nanopartículas complexas de composição e estrutura variável de acordo com o momento fisiológico e interação com o ambiente em que a bactéria está inserida. Com diversas funções, as VEBs podem ser carreadoras de fatores de virulência bastante eficientes, e induzir a resposta imune em plantas ativando mecanismos de resposta de defesa e necrose. Entretanto a resposta imune da planta em resposta à presença de vesículas extracelulares produzidas por bactérias fitopatogências tem sido pouco explorada. O objetivo deste trabalho foi caracterizar VEBs produzidas por Ralstonia pseudosolanacearum, infectadas pelo Ralstonia solanacearum inovirus brazil 1 (RSIBR1), analisar a resposta imune de plantas e possibilidade de imunização contra a murcha bacteriana por VEBs no processo de infecção por R. pseudosolanacearum. O tamanho das vesículas de bactérias não infectadas foi homogêneo, em contraste com bactérias infectadas, onde o tamanho das vesículas produzidas foi bastante heterogêneo. A produção de VEBs também foi afetada em bactérias infectadas pelo inovírus, com dez vezes menos vesículas produzidas quando comparadas com bactérias não infectadas. As vesículas purificadas a partir de culturas de bactérias infectadas e não infectadas causaram reação de hipersensibilidade e necrose tecidual em folhas de tomate, sendo possível observar um perfil fenotípico de resposta mais intensa em plantas infiltradas com VEBs purificadas, a partir da bactéria infectada. A expressão relativa dos genes das proteínas de patogênese classe 1a (pr1A), e semelhante a osmotina (olP) do sistema imune de plantas, obteve um aumento significativo para VEBs purificadas a partir de bactérias infectadas em relação as VEBs de bactérias não infectadas, nos dois períodos de avaliação. A infiltração de plantas com vesículas causou proteção parcial em plantas de tomate contra a murcha bacteriana, com sintomas brandos e reduzida taxa de mortalidade. Esse foi o primeiro relato de VEBs de R. pseudosolanacearum causarem proteção e contra efeitos graves da murcha bacteriana, sendo necessário maior investigação do conteúdo presente nas vesículas. Palavras-chave: vesículas extracelulares; ralstonia spp.; sistema imune de planta.The Ralstonia solanacearum Species Complex (RSSC) comprises Gram-negative phytopathogenic bacteria responsible for bacterial wilt, a disease of great importance in agriculture. This complex consists of three species (R. solanacearum, R. pseudosolanacearum, and R. syzygii), classified into four phylogenetic groups distributed across different geographical regions worldwide. The high genetic diversity, combined with a wide range of hosts and a high survival rate of the bacteria in the absence of a host plant, makes the disease difficult to control. In this context, the use of bacteriophages has proven to be a promising strategy for managing bacterial wilt caused by RSSC bacteria. Viruses that infect bacteria can multiply in various ways, resulting in different consequences for the host, ranging from cell lysis to chronic infections. Chronic infections, in turn, can induce significant phenotypic alterations in the host, affecting characteristics such as pathogenicity, growth, and biofilm formation, among others. Viruses classified in the family Inoviridae are viruses that chronically infect bacteria. As a consequence of this multiplication strategy, they cause various phenotypic modifications in the infected cells, including changes in aggressiveness in pathogenic bacteria. One of the alterations already described is the effect on the production and composition of bacterial extracellular vesicles (EVs). EVs are complex nanoparticles with variable composition and structure depending on the physiological state and interaction with the environment in which the bacterium is situated. With various functions, EVs can carry highly efficient virulence factors and induce plant immune responses by activating defense response mechanisms and necrosis. However, the immune response of plants in response to the presence of extracellular vesicles produced by phytopathogenic bacteria has yet to be explored. The objective of this study was to characterize EVs produced by Ralstonia pseudosolanacearum infected by Ralstonia solanacearum inovirus brazil 1 (RSIBR1), analyze the immune response of plants, and investigate the possibility of immunization against bacterial wilt through EVs during the infection process by R. pseudosolanacearum. The size of vesicles from uninfected bacteria was homogeneous, in contrast to infected bacteria, where the size of the produced vesicles was quite heterogeneous. The production of EVs was also affected in bacteria infected by the inovirus, with ten times fewer vesicles produced compared to uninfected bacteria. The purified vesicles from infected and uninfected bacteria cultures caused hypersensitivity reactions and tissue necrosis in tomato leaves, with a more intense phenotypic response observed in plants infiltrated with purified EVs from the infected bacteria. The relative expression of class 1a pathogenesis-related protein genes (pr1A) and osmotin-like protein (olP) in the plant immune system showed a significant increase for purified EVs from infected bacteria compared to uninfected bacteria during both evaluation periods. The infiltration of plants with vesicles partially protected tomato plants against bacterial wilt, resulting in mild symptoms and reduced mortality rates. This is the first report of EVs from R. pseudosolanacearum providing protection against severe effects of bacterial wilt, warranting further investigation of the content present in the vesicles. Keywords: extracellular vesicles; ralstonia spp.; plant’s immune system.