Utilização de diferentes técnicas de imobilização e aplicação biotecnológica de α-galactosidase extracelular de Debaryomyces hansenii UFV-1

Abstract

A presença de ROs, principalmente estaquiose e rafinose, em sementes de soja pode acarretar em distúrbios gastrointestinais em humanos. Isso ocorre porque, ao alcançar o intestino, os ROs são fermentados pela microbiota, produzindo gases que podem causar cólicas, inchaço, flatulência e diarreia. Os ROs apresentam ligações glicosídicas α–1,6 que não podem ser hidrolisadas devido à ausência da enzima α-galactosidase em humanos e animais. Uma alternativa para a remoção desses fatores antinutricionais é a aplicação da α-galactosidase no processamento da soja. Esta enzima catalisa a hidrólise de ligações α-1,6 de resíduos α- galactosídeos em oligossacarídeos simples como rafinose e estaquiose e em polissacarídeos como galactomananas. As α-galactosidases podem ser produzidas de diversos microrganismos, dentre eles Debaryomyces hansenii, levedura encontrada em produtos como queijos e salsichas, e que não apresenta restrição quanto à segurança, para o seu uso no processamento de alimentos. O alto custo para a obtenção da enzima limita a rentabilidade da grande maioria das aplicações. Com isso, a utilização de subprodutos de baixo custo como o soro de leite reduz o custo da enzima e contribui para a economia circular. A utilização de α-galactosidase apresenta diversos gargalos como a desnaturação, inativação, curta vida útil industrial, além da dificuldade de separá-la do meio em que se encontra. Uma alternativa para contornar essa problemática é a imobilização, que consiste em confinar fisicamente a enzima. Com a imobilização, as enzimas tendem a apresentar melhor estabilidade, reutilização e fácil separação do meio reacional, reduzindo assim o custo geral de aplicações industriais. Este estudo teve como objetivo verificar a produção da enzima α-galactosidase por D. hansenii UFV-1 utilizando o soro de leite como fonte de carbono. Posteriormente, realizar a imobilização da enzima utilizando diferentes técnicas e, por conseguinte, aplicar a enzima livre e imobilizada em leite de soja para avaliar a hidrólise dos oligossacarídeos de rafinose em leite de soja. No presente estudo foi possível observar que D. hansenii UFV-1 foi capaz de produzir a enzima α-galactosidase intra (0,274 U/mL) e extracelular (0,213 U/mL), utilizando somente o soro de leite como fonte de carbono. A enzima α-galactosidase extracelular foi escolhida para a realização das próximas etapas, para economia de tempo e energia. A enzima α-galactosidase extracelular apresentou pH e temperatura ótimos de 4,0 e 50 °C, respectivamente, além disso, apresentou ser termoestável durante 5 dias nas temperaturas de 50 e 60°C. Ademais, nas temperaturas de armazenamento testadas (25 e 4 °C) a enzima manteve sua atividade durante 5, 15 e 30 dias. Durante o tratamento do leite de soja, utilizando 0,02 U de enzima, foi possível observar os percentuais de hidrólise foram 8,0 e 2,8 e 8,1 e 2,8 % de estaquiose e rafinose, nos tempos 4 e 6 horas, respectivamente. Ao utilizar 0,08 U de enzima, os percentuais de hidrólise de estaquiose e rafinose foram 10,3 e 3,0 e 17 e 11 % nos tempos de 4 e 6 horas, respectivamente. A α- galactosidase imobilizada em alginato de cálcio e partículas magnéticas apresentou pH e temperatura ótimos de 6,0 e 50 °C e de 4,0 e 40 °C, respectivamente. Ambas as enzimas foram mais termoestáveis na temperatura de 50 °C. Em relação às temperaturas de armazenamento, a temperatura de 4 °C foi a que proporcionou maiores atividades enzimáticas e a enzima imobilizada em partículas magnéticas manteve mais de 90 % de sua atividade durante 5, 15 e 30 dias nessa temperatura. A enzima imobilizada em alginato de cálcio foi aplicada para hidrólise de oligassacarídeos de rafinose em leite de soja, devido ao seu baixo custo, não toxicidade e facilidade da técnica de imobilização. Durante 4 e 6 horas, e os percentuais de hidrólise obtidos foram 3,3 e 42 % para estaquiose e 11 e 45 %, para rafinose, respectivamente. Conclui-se que a α-galactosidase livre e imobilizada em alginato de cálcio e partículas magnéticas apresenta potencial para a hidrólise dos ROs em leite de soja, uma vez que todas as formas da enzima apresentaram pH ótimo na faixa acídica e atividade enzimática em altas temperaturas, fato que é de extrema relevância, uma vez que o pH do leite de soja normalmente está compreendido entre 6,4 e 6,8, e o processamento deste produto ocorre em temperaturas de 50 a 60° C. Além disso, a α-galactosidase livre apresentou-se termoestável durante 5 dias nas temperaturas utilizadas no processamento de soja. Ademais, a α-galactosidase imobilizada, tanto em alginato de cálcio quanto em partículas magnéticas, apresentou termoestabilidade em 50 e 60 °C por até 10 horas, o que é de extrema importância, visto que são nessas temperaturas e tempos que ocorre a hidrólise dos oligossacarídeos de rafinose presentes em leite de soja. Palavras – chave: α-Galactosidase; Alginato; Partículas magnéticas.Raffinose oligosaccharides (ROs) are carbohydrates present in legumes such as soybeans, lentils and beans. The presence of ROs, mainly stachyose and raffinose, in soybean seeds can lead to gastrointestinal disorders in humans. This occurs because when they reach the intestine they are fermented by the microbiota, producing gases that can cause cramps, bloating, flatulence and diarrhea. ROs have α–1,6 glycosidic bonds that cannot be hydrolyzed due to the absence of the enzyme α-galactosidase in humans and animals. An alternative for removing these antinutritional factors is the application of α-galactosidase in soybean processing. This enzyme catalyzes the hydrolysis of α-1,6 bonds of α-galactoside residues in simple oligosaccharides such as raffinose and stachyose and in polysaccharides such as galactomannans. α-Galactosidases can be produced from various microorganisms, including Debaryomyces hansenii, yeast found in fermented products rich in proteins, such as cheeses and sausages, and which has no restrictions regarding safety for its use in food processing. The high costs of obtaining the enzyme limits the profitability of most applications. Therefore, the use of low-cost byproducts such as whey reduces the costs of the enzyme and contributes to the circular economy. The use of α-galactosidase shows several bottlenecks such as denaturation, inactivation, short industrial useful life, in addition to the difficulty of separating it from the medium in which it is found. An alternative to overcome this problem is immobilization, which consists of physically confining the enzyme. With immobilization, enzymes tend to exhibit better stability, effective reuse, and easy separation from the reaction medium, thus reducing the overall cost of industrial applications. This study aimed to verify the production of the enzyme α-galactosidase by D. hansenii UFV-1 using whey as a carbon source. Subsequently, to immobilize the enzyme using different techniques and, therefore, apply the free and immobilized enzyme in soy milk to evaluate the hydrolysis of raffinose oligosaccharides. In the present study, it was possible to observe that D. hansenii UFV-1 could produce the enzyme α- galactosidase intra (0.274 U/mL) and extracellularly (0.213 U/mL), using only whey as a carbon source. Subsequently, the extracellular α-galactosidase enzyme was chosen to carry out the next steps, for time and energy savings. The extracellular α-galactosidase enzyme showed optimal pH and temperature of 4.0 and 50 °C, respectively. Furthermore, the free enzyme was thermostable for 5 days at temperatures of 50 and 60 °C. At the storage temperatures tested (25 and 4 °C) the enzyme maintained its activity for 5, 15 and 30 days. During the treatment of soy milk, using 0.02 U of enzyme, it was possible to observe hydrolysis percentages of 8.0 and 2.8 and 8.1 and 2.8 % of stachyose and raffinose, at times 4 and 6 hours, respectively. When using 0.08 U of enzyme, the hydrolysis percentages of stachyose and raffinose were 10.3 and 3.0 and 17 and 11 % at times of 4 and 6 hours, respectively. The α-galactosidase immobilized in calcium alginate and magnetic particles showed optimal pH and temperature values of 6.0 and 50 °C and 4.0 and 40 °C, respectively. Both enzymes were more thermostable at a temperature of 50 °C. Regarding storage temperatures, the temperature of 4 °C was the one that provided the greatest enzymatic activities, the enzyme immobilized in magnetic particles maintained more than 90 % of its activity during 5, 15 and 30 days at this temperature. The enzyme immobilized in calcium alginate was applied in soy milk for raffinose oligosaccharides hydrolysis for 4 and 6 hours, due to its low cost, non-toxicity and ease of immobilization technique, and the hydrolysis percentages obtained were 3.3 and 42 % and 11 and 45 % for stachyose and raffinose, respectively. It is concluded that the α-galactosidase in the forms free and immobilized, both in calcium alginate or magnetic particles, has potential in the hydrolysis of ROs in soy milk, since all forms of the enzyme showed optimal enzymatic activity at acidic pH values and high temperatures, which is of extreme relevance, since the pH of soy milk ranges from 6.4 to 6.8 and the processing of this product occurs at temperatures of 50 to 60 °C. Furthermore, the free α-galactosidase was thermostable for 5 days at the temperatures used in soybean processing. Additionally, the α-galactosidase immobilized in calcium alginate and magnetic particles showed thermostability at 50 and 60 °C for 10 hours, which is extremely important, since it is at these temperatures and times that hydrolysis of soy milk raffinose oligosaccharides occurs. Keywords: α-Galactosidase; Alginate; Magnetic particles.