Lipoproteína de Staphylococcus aureus: expressão e participação na invasão de células MAC-T em condições encontradas na glândula mamária bovina

Abstract

Lipoproteínas são proteínas de membrana encontradas em S. aureus que exercem diversas funções celulares e estão relacionadas à patogenicidade bacteriana. Um grupo especial de lipoproteínas, denominadas lipoproteínas-like (lpls) vem sendo associado à invasão em células humanas. Essas proteínas são codificadas por genes que estão organizados em um cluster localizado em uma ilha de patogenicidade. Um estudo realizado por nosso grupo identificou no genoma de S. aureus 302, cepa isolada de mastite bovina subclínica, um cluster contendo 6 lpls que têm uma identidade superior a 80%, porém baixa homologia com as lpls de S. aureus RF122, cepa associada à mastite clínica severa. Para avaliar o papel da Lpl na invasão de células imortalizadas do epitélio mamário bovino (MAC-T), uma Lpl de SAU302 foi expressa em Escherichia coli C41 e purificada por cromatografia de afinidade. O sequenciamento do clone comprovou a clonagem do gene de interesse. A proteína recombinante de 31 kDa foi expressa nas frações solúvel e insolúvel. Para os ensaios de invasão, células MAC-T foram incubadas por uma hora com concentrações de 35 a 4.375 µg/mL de lipoproteína recombinante antes da adição da bactéria. Observou-se que apenas as concentrações de 35 e 17,5 µg/mL aumentaram significativamente a invasão em 87% e 53%, respectivamente. Células MAC-T foram incubadas com S. aureus 302 por 30 minutos, 1:30 h e 3 h em meio DMEM contendo 0,6 mM de bipiridina (quelante de ferro), 0,6 mM de bipiridina e concentrações subinibitórias (0,5xCIM) de ampicilina, ciprofloxacina e gentamicina. No tempo de 30 minutos, houve diminuição de até 62% na invasão em todas as condições, quando comparadas ao controle. No tempo de 1 hora e 30 minutos, apenas o acréscimo de bipiridina causou diminuição significativa na invasão. No tempo de 3 horas, a combinação de bipiridina e ciprofloxacina e bipiridina e gentamicina diminuiu a invasão em 77,61% e 81,96%, respectivamente. Para analisar a expressão dos genes lpls, a cepa S. aureus 302 foi cultivada em diferentes condições de estresse, em meio BHI. A extração do RNA total foi feita da cultura na fase de crescimento estacionária, seguida de síntese do cDNA com random primers e RT-qPCR com primer complementar a todos os genes lpls. Observou-se que o acréscimo de bipiridina 0,6 mM, de concentrações subinibitórias de ciprofloxacina e o cultivo da bactéria a 39 ºC com ou sem presença de bipiridina 0,6 mM diminuiu significativamente a expressão dos genes lpls. O acréscimo de bipiridina 0,6 mM e concentrações subinibitórias de ampicilina, ciprofloxacina e gentamicina juntos diminuiu drasticamente a expressão. Os resultados confirmam a expressão de uma Lpl de S. aureus e sugerem que ela promove a invasão bacteriana. Este trabalho foi o primeiro a avaliar a expressão de genes que codificam lpls em condições que simulam o ambiente encontrado pela bactéria e sugere que a lipoproteína auxilia na invasão de células mamárias do epitélio bovino. Palavras-chave: Lipoproteína; Invasão celular; Expressão gênica.Lipoproteins are membrane proteins found in S. aureus that execute a variety of cellular functions and are related to pathogenicity. Lipoproteins-like (lpls), a special group of lipoproteins, has been associated with human cells invasion. These proteins are encoded by genes that are contained in a cluster located in a pathogenicity island. Previous studies made by our group identified in the genome of S. aureus 302, a strain isolated from subclinical bovine mastitis, a cluster containing 6 lpls with over 80% identity but low homology with lpls of S. aureus RF122, a strain associated with severe clinical mastitis. To assess the role of one Lpl in immortalized bovine mammary epithelial (MAC-T) cells invasion, a Lpl from SAU302 was expressed in Escherichia coli C41 and purified by affinity chromatography. Sanger’s sequencing confirmed the gene’s cloning. The 31 kDa recombinant protein was expressed in both soluble and insoluble fractions. For invasion assays, MAC-T cells were incubated for one hour with protein concentrations from 35 to 4.375 µg/mL before adding bacteria. Only 35 and 17.5 µg/mL significantly increased invasion by 87% and 53%, respectively. MAC-T cells were incubated with S. aureus 302 for 30 minutes, 1:30 h and 3 h in DMEM medium containing 0.6 mM bipyridine (iron chelator), 0.6 mM bipyridine and subinhibitory concentrations (0.5xMIC) of ampicillin, ciprofloxacin and gentamicin. After 30 minutes, invasion decreased up to 62% in treatments when compared to control. After 1 hour and 30 minutes, only the addition of bipyridine caused a significant decrease in invasion. At 3 hours, the combination of bipyridine and ciprofloxacin and bipyridine and gentamicin decreased invasion by 77.61% and 81.96%, respectively. To analyze lpls genes expression, S. aureus 302 strain was cultured under different stress conditions in BHI medium. Total RNA was extracted during the stationary growth phase, followed by cDNA synthesis with random primers and RT-qPCR with primers complementary to all lpls genes. Lpls genes expression significantly decreased with the addition of 0.6 mM bipyridine, subinhibitory concentrations of ciprofloxacin, and culturing the bacteria at 39 ºC with or without the presence of 0.6 mM bipyridine. Addition of 0.6 mM bipyridine and subinhibitory concentration of ampicillin, ciprofloxacin and gentamicin together drastically reduced expression. Results confirm the expression of a Lpl from S. aureus and suggest that it increases bacterial invasion. This study was the first to assess lpls genes expression under conditions that mimic the environment found by bacteria and suggests that lpls promote bovine mammary epithelial cells invasion. Keywords: Lipoproteins; Cellular invasion; Gene expression.