Sistemas de recuperação de ribossomos em Actinobacillus pleuropneumoniae: papel em virulência e resposta a diferentes condições de estresse

Abstract

A pleuropneumonia suína é uma doença respiratória causada pelo patógeno bacteriano Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) cujo sucesso na colonização e permanência nos pulmões do suíno está relacionado à sua capacidade de resistência a diferentes condições de estresse e a inúmeros fatores de virulência. Para o sucesso do patógeno, a síntese proteica eficiente é um gargalo, uma vez que este processo pode ser um fator limitante durante o crescimento e replicação bacterianos, e para isso há uma expressiva necessidade de ribossomos ativos dentro da célula. Em condições de estresse, os ribossomos podem ficar parados em uma fita de mRNA quando um códon de parada não é detectado, precisando, portanto, de um resgate ativo em um processo chamado trans-tradução. Um RNA pequeno denominado tmRNA, ubíquo em bactérias, codificado pelo gene ssrA, é responsável por mediar o mecanismo de trans-tradução. Muitas bactérias ainda apresentam dois sistemas adicionais mediados pelo fator de resgate alternativo A (alternative rescue factor A), ArfA, descrito em outras bactérias como Escherichia coli, Salmonella enterica e Yersinia pestis e o fator de recuperação alternativo B (alternative rescue factor B), ArfB presente em 34% dos genomas bacterianos já sequenciados. Este trabalho teve como objetivos investigar qual(is) sistema(s) de recuperação de ribossomos está(ão) presente(s) em A. pleuropneumoniae e qual o envolvimento deste(s) na virulência e na resposta a diferentes condições de estresse. Análises in silico e in vitro foram conduzidas com este propósito. Nossos resultados in silico mostraram que A. pleuropneumoniae possui apenas dois sistemas de recuperação de ribossomos, e o fato de não conseguirmos a obtenção de uma linhagem duplo mutante (∆ssrA_∆arfA) valida nosso resultado. Para verificar o envolvimento destes genes em virulência e resposta a condições de estresse, linhagens mutantes denominadas ∆ssrA e ∆arfA, bem como linhagens complementadas para as respectivas linhagens, ∆ssrAC e ∆arfAC, respectivamente, foram construídas a partir da linhagem APP MIDG2331 WT (sorotipo 8). Estas linhagens (WT, mutantes e complementadas) foram investigadas quanto ao crescimento in vitro, adesão, sensibilidade a antibióticos e a diferentes condições de estresse (oxidativo, osmótico, temperatura e etanólico). Além disso, a virulência destas linhagens foi analisada no modelo de infecção alternativo Galleria mellonella. Análises fenotípicas mostraram que o mutante ∆ssrA foi mais sensível antibióticos e a todas as condições de estresse se comparado à linhagem WT e ao mutante ∆arfA. Além disso, o mutante ∆ssrA apresentou menor capacidade de adesão e virulência atenuada em G. mellonella quando comparada com as linhagens WT e ∆arfA. A linhagem ∆ssrAC não mostrou uma restauração completa do fenótipo original. Entretanto, a linhagem ∆arfAC mostra uma restauração completa do fenótipo. Estes resultados mostram que o gene ssrA tem um papel importante na resistência ao estresse e na virulência em APP e a ausência do gene arfA não afetou o fitness da bactéria nas condições avaliadas. Diante desses resultados, podemos concluir que o sistema TmRNA/SmpB é o principal sistema de recuperação de ribossomos em A. pleuropneumoniae e que a falta do mesmo acarreta em atenuação do fenótipo de virulência e aumento da sensibilidade a condições de estresse.The porcine pleuropneumonia is a respiratory disease caused by the bacterial pathogen Actinobacillus pleuropneumoniae. The success of this bacterial pathogen on colonization and permanence in the pig’s lungs is related to their capability of stress resistance as well its virulence. Efficient protein biosynthesis, the main rate-limiting factor during bacterial growth and replication, depends on the concentration of active ribosomes within the cell. Ribosomes may become stalled on an mRNA strand when a stop codon is not detected, and active rescue of the ribosome (a process called trans- translation) is required to release it. Almost all bacteria encode a small RNA (tmRNA), encoded by the ssrA gene, which mediates trans-translation. An alternative rescue factor protein, ArfA, has also been described in bacteria such as Escherichia coli, Salmonella enterica, and Yersinia pestis. A second alternative rescue factor protein, ArfB, has been found in 34% of the bacterial genomes already sequenced. Both the ssrA and arfA genes are present in the genome of A. pleuropneumoniae, and the aim of this work was to characterize the respective contributions of these factors to stress response and virulence of this important swine pathogen. For this, simple mutants named ∆ssrA and ∆arfA, as well complemented strains for the mutants named ∆ssrAC and ∆arfAC, respectively, were constructed from APP MIDG2331 WT (serotype 8). These mutants, complemented strains and their parental strain were tested for their growth (in vitro conditions), adhesion, sensitivity to antibiotics and different stress conditions (oxidative, osmotic, temperature and ethanolic). Besides that, their virulence was tested in Galleria mellonella larvae model. Our results showed that A. pleuropneumoniae has only two ribosome rescue systems since it was not possible to get a double mutant strain (∆ssrA_∆arfA) and there is a high conservation of these genes among the A. pleuropneumoniae serotypes (1-16) analyzed in silico. Phenotypic analyses showed that ∆ssrA mutant presented more sensitivity to the antibiotics and all stress conditions tested, had a minor adhesion capability and its virulence was more attenuated in G. mellonella when compared with the parental and the ∆arfA mutant strains. Furthermore, the ∆ssrAC did not show a complete phenotype restoration. This strain has it growth, adhesion and virulence behavior very similar to the ∆ssrA mutant. Opposed to the ∆ssrAC, the ∆arfAC strain shows a complete phenotype restoration. These results show that the ssrA gene have an important role in the virulence and stress resistance on APP and the lack of the arfA gene did not affect the bacterial fitness. Then, we can conclude that the ribosome rescue system based on TmRNA/SmpB mediates the main ribosome rescue system in A. pleuropneumoniae.