Construção de uma linhagem recombinante de Kluyveromyces marxianus UFV-3 para expressão da proteína não estrutural (NS1) do vírus da dengue-1

Abstract

A levedura Kluyveromyces marxianus tem sido considerada uma candidata hospedeira para a síntese industrial de biomoléculas. Apesar de seu potencial, são poucos os estudos que relatam a expressão de proteínas heterólogas utilizando esta levedura. Neste trabalho, foi relatado pela primeira vez, a expressão da proteína do vírus da dengue em K. marxianus. O gene que codifica a proteína não estrutural (NS1) do vírus da dengue-1 foi integrado no genoma da levedura K. marxianus UFV-3 no locus LAC4, utilizando um vetor integrativo adaptado projetado para expressão de proteínas recombinantes em Kluyveromyces lactis. O gene de dengue-1 NS1 foi otimizado utilizando os códons preferenciais para aumentar os níveis de expressão de proteínas em leveduras. O gene sintético foi clonado “in frame” com o peptídeo sinal (mating-α-factor) de K. lactis e o plasmídeo recombinante obtido foi utilizado para transformar K. marxianus UFV-3 por eletroporação. As células transformantes selecionadas em YPD (yeast extract peptone dextrose) contendo 200 ug mL-1 de geneticina foram mitoticamente estáveis. A análise das linhagens recombinantes por meio de RT-PCR e a detecção da proteína utilizando Dot-blot confirmou a transcrição e a expressão dos peptídeos extracelulares. Após a indução com galactose, a proteína NS1 foi analisada por SDS-PAGE e Western blot. A produção da proteína foi investigada sob duas condições: com pulso de galactose e biotina com intervalos de 24 horas durante 96 horas após a indução e sem pulso de galactose e biotina. A atividade proteolítica não foi detectada no sobrenadante das culturas. Nossos resultados indicam que células recombinantes de K. marxianus podem ser consideradas boas hospedeiras para a produção de proteínas do vírus de dengue, que têm um potencial para aplicações em diagnósticos.

The yeast Kluyveromyces marxianus has been considered a candidate host for industrial synthesis of biomolecules. Despite its potential, there are few studies reporting the expression of heterologous proteins using this yeast. Here, it was reported for the first time a dengue viral protein expression in K. marxianus. The dengue virus type 1 nonstructural protein 1 (NS1) was integrated into the K. marxianus UFV-3 genome at the LAC4 locus using adapted integrative vector designed for high-level expression of recombinant protein in Kluyveromyces lactis. The gene of dengue-1 NS1 was optimized using preferential codons to increase the levels of proteins expression in yeast. The synthetic gene was cloned in frame with K. lactis mating-α-factor signal peptide and the recombinant plasmid obtained was used to transform K. marxianus UFV-3 by electroporation. The transformants cells selected in Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) containing 200 μg mL-1 Geneticin were mitotically stable. The analysis of recombinant strains by RT-PCR technique and the protein detection using blot analysis have confirmed both transcription and expression of the extracellular peptides. After induction with galactose, the NS1 protein was analyzed by SDS-PAGE and immunogenic detection. The protein production was investigated under two conditions: with galactose and biotin pulse at 24 hours intervals during 96 hours of induction and without galactose and biotin pulse. Protease activity was not detected into the medium. Our results indicate that the constructed recombinant K. marxianus can be considered good host for the production of dengue virus proteins, which have a potential for diagnostic applications.