Desenvolvimento e expressão gênica em oócitos bovinos imaturos selecionados por Azul Cresil Brilhante

Abstract

A eficiência da produção in vitro de embriões (PIV) tem sido limitada pelas condições de cultivo in vitro e baixa competência dos oócitos utilizados na maturação in vitro. A utilização do corante Azul Cresil Brilhante (ACB) associado à seleção morfológica convencional, tem sido descrita como uma alternativa para seleção de oócitos de melhor qualidade. Objetivou-se neste trabalho avaliar o uso do ACB como método de seleção de oócitos imaturos bovinos, utilizando como parâmetros de avaliação o desenvolvimento embrionário e a expressão de genes envolvidos na transição do genoma materno-zigótica. Na primeira etapa, um total de 998 oócitos foram distribuídos em 4 grupos: G1-Controle: oócitos submetidos à maturação sem exposição ao corante ; G2- Controle de incubação (mPBS): oócitos mantidos em mPBS por 1h a temperatura de 38,5º C em ar atmosférico; G3-ACB+: oócitos mantidos em mPBS adicionado de ACB, nas mesmas condições de G2, que apresentaram ao final da incubação citoplasma corado; G4- ACB-: oócitos mantidos em mPBS adicionado de ACB nas mesma condições de G2, que ao final da incubação apresentaram citoplasma incolor. Os oócitos de cada tratamento foram maturados, fertilizados e os possíveis zigotos cultivados in vitro por oito dias. As taxas de clivagem foram obtidas 48h após inicio do cultivo e as taxas de blastocistos oito dias após fecundação. As taxas de clivagem de G1 e G3 foram semelhantes, no entanto foram maiores que G2 e G4, as quais semelhantes. Os oócitos G3 apresentaram taxas de blastocisto semelhantes ao G1 e G2, mas foram maiores do que o G4. Na segunda etapa, o RNA total foi extraído de três pools de 12 oócitos imaturos obtidos dos mesmos tratamentos acima descritos e usados para gerar cDNA. A abundância relativa dos transcritos MATER e Zar-1 foi analisada por Real Time-PCR. Não foi encontrada diferença na expressão relativa dos transcritos MATER e Zar-1 entre os tratamentos. Em conclusão, à seleção morfológica convencional associada à seleção pelo corante ACB pode ser usada como método de seleção de oócitos imaturos, distinguindo duas populações de oócitos com diferente competência de desenvolvimento, no entanto esta dupla seleção não selecionou oócitos mais competentes quando utilizado unicamente o critério morfológico convencional de seleção. Além disso, o corante não foi capaz de selecionar oócitos com diferente padrão na expressão dos transcritos MATER e Zar-1.

The in vitro embryo production (IVP) efficiency has been limited by oocyte developmental competence and in vitro culture conditions. The use of Brilliant Cresyl Blue (BCB) dye has been described as an alternative method for selection of better quality oocytes. The aim of this work was to evaluate the selection of immature oocytes by BCB dye and the expression of transcripts involved in the transition from genome-maternal. In the first step, a total of 998 immature oocytes was distributed into: G1- Control: oocytes sent directly to in vitro maturation, not exposed to the dye; G2- Control incubation (mPBS): oocytes exposed to mPBS solution without BCB for 1h; G3- BCB+: oocytes exposed to mPBS added of BCB and positively stained; G4- BCB-: oocytes exposed to mPBS with BCB and colorless. Oocytes of each treatment were matured, fertilized and presumptive zygotes were cultured in vitro for eight days. The rates of cleavage were obtained at 48h after the beginning of the culture and the rates of blastocysts at eight days post fertilization. The cleavage rates between G1 and G3 were similar, but higher than G2 and G4, the ones which similar. The oocytes in G3 showed blastocyst rate similar to the G1 and G2, but higher than G4. In another step, total RNA was extracted from three pools of 12 immature oocytes obtained from each group and used to generate cDNA. The relative abundance of MATER and Zar-1 transcripts was analyzed by Real Time PCR. No difference was found on relative expression for MATER and Zar-1 among groups. In conclusion, the conventional morphologic selection associated to the selection by BCB dye can be used as method of selection of immature oocyte, distinguishing two oocytes populations with different development competence, however this double selection did not select more competent oocytes when used only the conventional morphologic assessment. Moreover, the dye is not able to select oocytes with different patterns of expression transcripts MATER and Zar-1.