Perfil de expressão de transcritos e de microRNAs no desenvolvimento da competência de oócitos de vacas da raça Gir (Bos taurus indicus)

Abstract

O gado Gir possui alto desempenho e tem sido sistematicamente selecionado no Brasil, utilizando ferramentas de seleção fenotípica. Atualmente, critérios de seleção para programas de melhoramento genético estão sendo aplicados visando melhor desempenho em características produtivas e reprodutivas, como a produção de embriões in vitro. A presença de miRNAs tem sido estudada e confirmada em todos os tecidos reprodutivos, tipos de células e fluídos biológicos, sinalizando importante papel na gametogênese e no desenvolvimento embrionário. De fato, há evidências acumuladas nos últimos anos sobre a expressão diferencial de miRNAs em diferentes estágios de desenvolvimento folicular, oocitário e embrionário e sua associação com o desenvolvimento normal de gametas e embriões. Mudanças no crescimento e na diferenciação de células da granulosa (GCs) e células do cumulus (CCs) durante a foliculogênese podem afetar diretamente o processo de maturação dos oócitos e o entendimento destes mecanismos pode ser uma ferramenta promissora para a seleção de oócitos de melhor qualidade. Diante disso, as hipóteses do trabalho são: 1) há miRNAs envolvidos no mecanismo de competência oocitária, 2) os genes BMP15, GDF9, NPPC, GJ1, GPR3 e GJ4, regulam o mecanismo de competência oocitária. Para início das coletas , 4 vacas da raça Gir foram submetidas a protocolos de sincronização estral. A partir de então, estas fêmeas eram semanalmente aspiradas até se obter 6 oócitos de cada animal, juntamente com fluído folicular, GCs e complexo cumulus-oócito (CCO). Após as aspirações os CCOs eram levados a laboratório, classificados morfologicamente, e incubados com 20 l do corante Azul Brilhante Cresil (BCB) diluido em PBS na concentração de 26 µM por 1h em estufa com atmosfera de 5% de CO2 em ar, e temperatura de 38°C . As GCs foram separadas do fluído folicular pelo processo de centrifugação. O CCO após a coloração, foi classificado em BCB- e BCB+. Tanto GCs quanto fluido folicular e CCOs foram estocados em nitrogênio líquido. O RNA total foi extraído conjuntamente de fluído folicular, GCs e CCOs para cada vaca e a expressão dos genes NPPC, BMP15, GDF9, GJ1, GJ4 e GPR3 e dos miRNAs correlacionados com os genes alvos, bta- mirR 138 (gene NPPC) e bta-miR 193a-5p (gene GPR3), foi avaliada por qPCR. O Test- t foi utilizado para comparar as médias dentro de cada tratamento (BCB+ e BCB- ) para genes e miRNA. Os resultados foram considerados significativos quando atingido o valor de P<0,05. Os genes NPPC, BMP15, GDF9, GJ1, GJ4 e GPR3 não apresentaram diferenças significativas na sua expressão entre os tratamentos BCB+ e BCB-, enquanto ambos miRNAs apresentaram diferença significativa na sua expressão. Esses resultados podem ser explicados pela fase do ciclo estral em que os animais tiveram seus folículos ovarianos aspirados não havendo diferenças na expressão dos genes relacionados a competência oocitária, ou mesmo pelo tamanho dos foclículos aspirados, entre 4 a 8 mm, denotando sua maturação. Outra explicação seria a ativação de diferentes vias gênicas, levando a competência oocitária, diferente da que foi analisada neste projeto. Quanto aos miRNAs foi possível observar a relação de ambos no desenvolvimento da competência oocitária controlando a expressão pós transcricional dos genes analisados NPPC e GPR3, não obstante não se pode descartar a possibilidade destes miRNAs estarem controlando outros transcritos, visto que miRNAs são conhecidos por serem moléculas multi-alvos. Estes achados indicam a necessidade de estudos futuros, nos quais o papel de reguladores de transcrição de ambos os miRNAs deverá ser validado pela análise de expressão para as proteínas Natriuretic Peptide C (NPPC) e G Protein-Coupled Receptor 3 (GPR3). Palavras-chave: miRNA. Competência oocitária. Maturação.

Gyr cattle have high performance and have been systematically selected in Brazil, using phenotypic selection tools. Currently, selection criteria for genetic improvement programs are being applied aiming at better performance in productive and reproductive traits, such as in vitro embryo production. The presence of miRNAs has been studied and confirmed in all reproductive tissues, cell types and biological fluids, indicating an important role in gametogenesis and embryonic development. In fact, there are several evidences accumulated in recent years on the differential expression of miRNAs at different stages of follicular, oocyte and embryonic development and their association with the normal development of gametes and embryos. Changes in the growth and differentiation of granulosa cells (GCs) and cumulus cells (CCs) during folliculogenesis may directly affect the oocyte maturation process and the understanding of these mechanisms can be a promising tool for the selection of better- quality oocytes. Therefore, the hypotheses of this work are: 1) there are miRNAs involved in the oocyte competence mechanism; 2) the genes BMP15, GDF9, NPPC, GJ1, GPR3 and GJ4 regulate the oocyte competence mechanism. To start the collections, 4 Gir cows were submitted to estrous synchronization protocols. From then on, these females were aspirated weekly until 6 oocytes were obtained from each animal, together with follicular fluid, GCs and cumulus-oocyte complex (CCO). After the aspirations, the COCs were taken to the laboratory, morphologically classified, and incubated with 20 µl of Cresyl Brilliant Blue dye (BCB) diluted in PBS at a concentration of 26 µM for 1 h in an oven with an atmosphere of 5% CO2 in air, and temperature of 38°C. GCs were separated from the follicular fluid by the centrifugation. The CCO after staining was classified into BCB- and BCB+. Both GCs and follicular fluid and COCs were stored in liquid nitrogen. Total RNA was extracted together from follicular fluid, GCs and COCs for each cow and the expression of the NPPC, BMP15, GDF9, GJ1, GJ4 and GPR3 genes and the miRNAs correlated with the target genes, bta-mirR 138 (NPPC gene) and bta-miR 193a-5p (GPR3 gene), was evaluated by qPCR. The t-Test was used to compare means within each treatment (BCB+ and BCB-) for genes. Results were considered significant when P<0.05 was reached. The NPPC, BMP15, GDF9, GJ1, GJ4 and GPR3 genes did not show significant differences in their expression between BCB+ and BCB- treatments, while both miRNAs showed significant difference in their expression. These results can be explained by the phase of the estrous cycle in which the animals had their ovarian follicles aspirated, with no differences in the expression of genes related to oocyte competence, or even by the size of the aspirated follicles, between 4 and 8 mm, denoting their maturation. Another explanation would be the activation of different gene pathways, leading to oocyte competence, different from what was analyzed in this project. As for the miRNAs, it was possible to observe the relationship of both in the development of oocyte competence by controlling the post-transcriptional expression of the analyzed genes NPPC and GPR3, however, the possibility of these miRNAs controlling other transcripts cannot discarded, since miRNAs are known to be molecules multi targets. These findings indicate the need for future studies, in which the role of transcriptional regulators of both miRNAs should be validated by expression analysis for Natriuretic Peptide C (NPPC) and G Protein-Coupled Receptor 3 (GPR3) proteins. Keywords: miRNA. Oocyte competence. Maturation.