Identification and gene expression analysis of genes encoding lactose permease and β- galactosidase in the Basidiomycota yeast Papiliotrema laurentii

Abstract

Ricotta whey, an effluent generated by the dairy industry during the ricotta cheese manufacturing, is rich in the disaccharide lactose. Our research group recently isolated from soil the oleaginous yeast Papiliotrema laurentii UFV-1, which grows and produces lipids from this effluent, paving the way toward its application in third-generation biodiesel production. Nevertheless, increasing lipid production parameters is pivotal to make the bioprocess feasible. Over the last years, metabolic engineering has contributed to enhance the fermentative performance of yeasts in bioprocesses. However, improving lipid production by P. laurentii UFV-1 through metabolic engineering strategies is not a trivial task, as the proteins involved with lactose metabolism are so far unknown. Therefore, the identification of the genes responsible for lactose metabolism in P. laurentii UFV-1 is required for applying metabolic engineering strategies to increase lipid production on lactose-rich substrates, such as ricotta whey. Thus, this study aimed to identify and analyze the expression of the genes encoding putative lactose permeases and the β-galactosidase enzymes in P. laurentii UFV-1. By using bioinformatics tools, we identified the genes encoding lactose permease (Papla_5974) and β-galactosidase (Papla_5976). Surprisingly, we also identified a transcription factor gene (Papla_5975) between both genes. The three genes are on the same chromosome near each other, constituting a gene cluster. To evaluate the expression of these genes, we cultivated P. laurentii UFV-1 in Yeast Nitrogen Base (YNB) medium containing glucose, galactose, or lactose as the sole carbon sources. Besides, we cultivated this yeast in a YNB medium containing two carbon sources: glucose and lactose, and glucose and galactose. We quantified the gene expression via RT-qPCR at different growth stages. The lactose permease gene was induced in the presence of both lactose and galactose; otherwise, the β- galactosidase gene was induced only by lactose. For instance, it is unclear whether the transcriptional factor is involved in the activation of the genes encoding lactose permease and β-galactosidase. Notably, the expression of the transcriptional factor increased in the late stationary phase for glucose and lactose; thus, it may play a role under nutrient-limiting conditions. Furthermore, P. laurentii UFV-1 exhibited diauxic growth, which is consistent with the repression of the lactose permease and β-galactosidase genes by glucose in cultivations with glucose plus lactose and glucose plus galactose. Therefore, we describe for the first time a cluster of genes related to lactose metabolism in a Basidiomycota yeast, opening perspectives to improve lipid production by lactose-based media such as ricotta whey. Keywords: Ricotta whey. Lactose. Oleaginous yeast. Lipid production. Cluster genes

O soro de ricota, efluente gerado pela indústria de laticínios durante a fabricação de ricota, é rico no dissacarídeo lactose. O nosso grupo de pesquisa isolou recentemente a levedura Papiliotrema laurentii UFV-1, que é capaz de crescer neste efluente e produzir lipídios, abrindo perspectivas para sua aplicação na produção de biodiesel de terceira geração. No entanto, é crucial aumentar os parâmetros de produção de lipídios para tornar o bioprocesso viável. Nos últimos anos, a engenharia metabólica tem contribuído para melhorar o desempenho fermentativo de leveduras em bioprocessos. No entanto, melhorar a produção de lipídios por P. laurentii UFV-1 por meio de estratégias de engenharia metabólica não é trivial, uma vez que as proteínas envolvidas no metabolismo do açúcar lactose são desconhecidas até o momento. Sendo assim, faz-se necessária a identificação dos genes responsáveis pelo metabolismo desse açúcar em P. laurentii UFV-1 para aplicar estratégias de engenharia metabólica visando o aumento da produção de lipídios em substratos ricos em lactose, como o soro de ricota. Assim, este estudo teve como objetivo a identificação e análise da expressão dos genes que codificam a permease de lactose e a enzima β- galactosidase em P. laurentii UFV-1. Empregando ferramentas de bioinformática, identificamos os genes que codificam a permease de lactose (Papla_5974) e a β-galactosidase (Papla_5976). Surpreendentemente, foi identificado um gene que codifica um fator de transcrição (Papla_5975) entre os genes do metabolismo de lactose descritos acima. Os três genes estão no mesmo cromossomo e próximos entre si, constituindo um cluster gênico. Para avaliar a expressão desses genes, P. laurentii UFV-1 foi cultivada em meio Yeast Nitrogen Base (YNB) contendo glicose, galactose ou lactose como únicas fontes de carbono. Além disso, essa levedura foi cultivada em meio YNB contendo duas fontes de carbono: glicose e galactose, e glicose e lactose. A quantificação da expressão gênica foi realizada via RT-qPCR em diferentes estágios de crescimento. O gene da permease de lactose foi induzido na presença de lactose e galactose, enquanto o gene da β-galactosidase foi induzido apenas por lactose. Ademais, não está claro se o fator transcricional está envolvido na ativação dos genes que codificam a permease de lactose e a β-galactosidase. A expressão do fator transcricional aumentou notavelmente na fase estacionária tardia para os cultivos em glicose ou lactose; assim, ele pode estar envolvido com respostas relacionadas à limitação nutricional. P. laurentii UFV-1 apresentou crescimento diáuxico, condizente com a repressão dos genes da permease de lactose e β-galactosidase por glicose em meios de cultivos contendo glicose com lactose, e glicose com galactose. Assim, foi descrito pela primeira vez um cluster de genes relacionados ao metabolismo da lactose em uma levedura Basidiomycota, abrindo perspectivas para melhorar a produção de lipídios em substratos a base de lactose, como o soro de ricota. Palavras-chave: Soro de ricota. Lactose. Levedura oleaginosa. Produção de lipídeos. Agrupamento gênico