Detecção de Pseudomonas fluorescens em leite cru pela reação em cadeia da polimerase

Abstract

Entre os micro-organismos psicrotróficos que são capazes de crescer durante a refrigeração, alguns produzem proteases termorresistentes relacionadas com problemas tecnológicos nos derivados lácteos. Visto que a demanda por métodos que permitem alta taxa de processamento exigida em indústrias de alimentos para controle da qualidade de leite cru é crescente, a avaliação de métodos mais sensíveis e mais rápidos para detecção de psicrotróficos, especialmente Pseudomonas fluorescens, espécie predominante, é de grande importância. Com a finalidade de estabelecer um protocolo para detecção de P. fluorescens pela reação em cadeia da polimerase (PCR), foram avaliados cinco métodos de extração de DNA total do leite, dois genes alvos na PCR e o limite de detecção dos métodos para análise de leite cru e leite esterilizado e inoculado com P. fluorescens. O kit comercial e o método de filtração modificado foram os métodos mais adequados para extração de DNA total de amostras de leite, por isso, foram utilizados nas análises seguintes para detecção dos genes alvos. No entanto, a utilização do método de filtração modificado para análise de leite inoculado com P. fluorescens e leite cru resultou em um menor limite de detecção quando comparado com o kit comercial. Por meio da amplificação do gene alvo rDNA 16S, foi possível observar um amplificado de 850 pb quando a população do leite inoculado com P. fluorescens era da ordem de 102 UFC/ml. Em amostras de leite cru, foi possível detectar o produto quando a contagem de Pseudomonas era da ordem de 106 UFC/ml e a população de psicrotróficos estava entre 107 e 109 UFC/ml. A análise do grau de proteólise das amostras de leite cru por eletroforese em gel de poliacrilamida demonstrou que a relação entre a população de psicrotróficos e a degradação das proteínas do leite depende de outros fatores além da contagem de psicrotróficos.

Among the psychrotrophic micro-organisms that are able to grow during refrigeration, some of them produce thermostable proteases which can cause many technological problems in the dairy industry. The food industries need to high throughput methods for the quality control raw of milk, thus, fast and sensitive methods for psychrotrophic detection, specially Pseudomonas fluorescens, predominant specie, are economically interesting to the dairy industry. In order to establish a protocol for the detection of P. fluorescens by using the polymerase chain reaction (PCR), five DNA extraction methods for milk samples, two target genes for the PCR amplification and the detection limit in raw milk and sterilized milk inoculated with P. fluorescens were evaluated. A commercial DNA extraction kit and a modified filtration method were the most appropriate for successfully bacterial DNA extraction from milk samples. These methods were selected and used for the detection of the target genes. Nevertheless, the modified filtration method was more efficient showing a lower detection limit in raw milk and sterilized milk inoculated with P. fluorescens. By means of PCR amplification of the 16S rRNA target gene, an 850 bp amplicon was observed and it was possible to detect as few as 102 UFC/ml of P. fluorescens from inoculated milk. In raw milk samples, Pseudomonas and psychrotrophic bacteria were detected at 106 UFC/mL and 107 to 109 UFC/mL, respectively. The relationship between the psychrotrophic population and the degradation of milk proteins was evaluated by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The results showed the proteolysis degree in raw milk doesn t depend just on the psychrotrophic bacteria count.