Desenvolvimento de moléculas aplicadas no diagnóstico sorológico e molecular de doenças bovinas

Abstract

Falhas reprodutivas que afetam animais de produção geralmente são causadas por agentes infecciosos e geram enormes prejuízos aos produtores. Entre estes patógenos estão os protozoários da tripanossomíase e neosporose bovina. As principais técnicas de diagnóstico se baseiam na percepção dos sinais clínicos, que são inespecíficos. Logo, buscamos estabelecer metodologias eficientes e de baixo custo para desenvolvimento de moléculas que possam ser aplicadas em plataformas de diagnóstico destas duas protozooses. Primeiro, utilizamos da tecnologia do phage-display para rastrear epítopos que diferenciassem soros de animais tripanossomíase positivo daqueles coletados de animais saudáveis, a fim de selecionar uma proteína de Trypanosoma vivax para uso no diagnóstico sorológico da infecção. As análises sorológicas indicaram sensibilidade de 88,9% e especificidade de 89,3%, no diagnóstico da tripanossomíase. No segundo capítulo, foi aplicado um rastreio computacional no desenho de uma proteína quimérica para o diagnóstico da neosporose. As análises dos testes sorológicos indicaram sensibilidade de 96,6% e especificidade de 97% na diferenciação dos soros. Na terceira parte, foi estabelecida uma metodologia para seleção de aptâmeros específicos para proteínas-alvo, através de uma metodologia de baixo custo, aplicada para prospecção de aptâmeros que detectem diretamente o patógeno. Um total de cinco sondas de oligonucleotídeos foram identificadas pelo método de Evolução Sistemática de Ligantes por Enriquecimento Exponencial (SELEX) aplicado a alvos proteicos. As evidências experimentais encontradas sugerem que as três metodologias são promissoras e permitem a triagem de novos testes para o diagnóstico de baixo custo, otimizados para uma detecção Point-of-care (POC). Palavras-chave: Phage-display. Aptâmero. Proteína quimérica. Triagem computacionalReproductive failures that affect farm animals are usually caused by infectious agents and generate huge losses for producers. Among these pathogens are trypanosomiasis and neosporosis bovine protozoan. The main diagnostic techniques are based on the perception of nonspecific clinical signs. Therefore, we seek to establish efficient and low-cost methodologies for the development of molecules that can be applied in diagnostic platforms for these two protozooses. First, we used the phage-display technology to screen epitopes that differentiate sera from positive trypanosomiasis animals from those collected from healthy animals, to select a Trypanosoma vivax protein for use in the serological diagnosis of the infection. Serological analyzes indicated a sensitivity of 88.9% and specificity of 89.3% in the diagnosis of trypanosomiasis. In the second chapter, a computational screening was applied in the design of a chimeric protein for the diagnosis of neosporosis. The analyzes of the serological tests indicated a sensitivity of 96.6% and specificity of 97% in the differentiation of sera. In the third part, a methodology for the selection of specific aptamers for target proteins was established, through a low-cost methodology, applied prospecting aptamers that will directly detect the pathogen. A total of five oligonucleotide probes were identified by the method of Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment (SELEX) applied to protein targets. The experimental evidence found suggests that the three methodologies are promising and allow the screening of new tests for low-cost diagnosis, optimized for a Point-of-care (POC) detection. Keywords: Phage-display. Aptamer. Chimeric protein. Computational screening.