Produção do domínio de ligação ao receptor do coronavírus da síndrome respiratória aguda grave 2 utilizando Komagataella phaffii

Abstract

O coronavírus da síndrome respiratória aguda grave 2 (SARS-CoV-2, espécie Betacoronavirus pandemicum) emergiu em dezembro de 2019 em Wuhan na China e rapidamente se espalhou pelo mundo, alcançando o status de pandemia em março de 2020. O vírus é transmitido pelo ar por meio de gotículas e aerossóis contaminados, afetando principalmente o trato respiratório. A proteína spike (S) está presente na superfície viral, sendo responsável pela ligação ao receptor humano enzima conversora de angiotensina 2 (ACE2) por meio de interação entre ACE2 e o domínio de ligação ao receptor (RBD). A proteína S e o domínio RBD tem sido extensamente empregados em diversas aplicações biotecnológicas. O desenvolvimento de tecnologias nacionais para o controle da pandemia é de extrema importância para o enfrentamento da pandemia e preparo para possíveis pandemias no futuro, de modo que a independência da importação de produtos implica numa resposta mais rápida em emergências de saúde pública. Visto que a produção de antígenos para testes diagnóstico e vacinas contribui para o encarecimento destes produtos, a utilização de leveduras para produção de proteínas recombinantes é uma alternativa atrativa para a produção de antígenos dada sua grande capacidade de expressão, bom custo-benefício e capacidade de escalonamento. Neste contexto, este trabalho descreveu a expressão de RBD das linhagens selvagem, Alfa, Beta e Gama de SARS-CoV-2 utilizando a levedura metilotrófica Komagataella phaffii. As proteínas recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade. A imunodetecção foi realizada com anticorpo para cauda de polihistidinas, anti-Spike e pool de soros de IgG positivos para SARS-CoV-2. Ensaio de deglicosilação com a enzima PNGase F foi realizado para detecção de glicoformas da proteína. Além disso, a identidade das RBDs recombinantes foi confirmada por espectrometria de massas. IgG ELISA foi realizado para verificar a potencial aplicação das RBDs como antígenos de captura e sua capacidade de discriminação entre amostras soropositivas e soronegativas de COVID-19. Diferentes condições de ensaio foram empregadas para melhorar os parâmetros de sensibilidade e especificidade, que variaram de 65.22-73.91% e 58.33-75%, respectivamente. A melhor condição empregou as proteínas digeridas com a endoglicosidase PNGase F e adição de manose ao tampão de diluição dos soros. O resultado dos testes para as quatros variantes de RBD variaram de sensibilidade de 55-76.09% e especificidade de 59.57-74.47%. RBD da linhagem selvagem teve o melhor resultado, com sensibilidade de 76.09% e especificidade de 74.47%, valores moderados para um teste diagnóstico. Já as RBD recombinantes de Alfa, Beta e Gama obtiveram valores menores, refletindo baixo poder discriminatório entre soros IgG positivos e negativos. Os resultados obtidos indicam que a proteína RBD da linhagem selvagem possui potencial para detecção de anticorpos anti-RBD, porém mais testes de otimização são necessários para melhorar os parâmetros de sensibilidade e especificidade. Palavras-chave: SARS-CoV-2; Coronavírus; RBD; COVID-19; Ferramentas diagnósticas.

Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2, Betacoronavirus pandemicum specie) emerged in December 2019 in Wuhan, China, and quickly spread around the world, reaching pandemic status in March 2020. The virus is transmitted through the air in contaminated droplets and aerosols and mainly affects the respiratory tract. The spike protein (S) is located on the viral surface and is responsible for binding the human receptor angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) through interaction between ACE2 and the receptor binding domain (RBD). In addition, RBD contains important antigenic sites used in the neutralizing immune response. S protein and RBD have been extensively employed in many biotechnological purposes. The development of national technologies to control the pandemic is extremely important for pandemic preparedness, so that the independence of importing products implies a faster response to public health emergencies. Since the production of antigens for diagnostic tests and vaccines contributes to increase the cost of these products, the use of yeasts to produce recombinant proteins is an attractive alternative to produce antigens given their high protein expression rates, good cost-benefit, and scalability. In this context, this work describes the expression of RBD from SARS-CoV-2 wild type, and Alpha, Beta, and Gamma variants using the methylotrophic yeast Komagataella phaffii. Recombinant proteins were purified by affinity chromatography. Immunodetection was performed with anti-polyhistidine tag, anti-Spike and pooled sera from COVID-19 seropositive individuals. A deglycosylation assay with enzyme PNGase F was performed to detect protein glycoforms. The identity of the recombinant RBDs was confirmed by mass spectrometry. IgG ELISA was performed to assess the potential of RBDs as capturing antigens and discriminating ability of COVID-19 seropositive and seronegative sera samples. Different assay conditions were employed to improve sensitivity and specificity parameters, which ranged from 65.22-73.91% and 58.33-75%, respectively. The test results for the four RBD variants ranged from sensitivity of 55-76.09% and specificity of 59.57-74.47%. The best condition used proteins digested with the endoglycosidase PNGase F and addition of mannose to the serum dilution buffer. Test results for the four RBD variants ranged in sensitivity from 55-76.09% and specificity from 59.57-74.47%. RBD from the wild line had the best result, with sensitivity of 76.09% and specificity of 74.47%, moderate values for a diagnostic test. The recombinant RBDs from Alpha, Beta and Gamma variants obtained lower values, reflecting low discriminatory power between positive and negative IgG sera. The results obtained indicate that the wild-type RBD protein has potential for detecting anti-RBD antibodies, but further optimization tests are necessary to improve sensitivity and specificity parameters. Keywords: SARS-CoV-2; Coronavirus; RBD; COVID-19; Diagnostic tools.