Identificação e caracterização de um peptídeo antimicrobiano de Hypsiboas semilineatus

Abstract

Os antibióticos revolucionaram o tratamento das doenças infecciosas, especialmente por terem como alvos moléculas e processos que são essenciais à vida bacteriana. Mas, o uso extensivo e indiscriminado destes agentes antibacterianos também introduziu uma grande pressão seletiva nas espécies e a consequente emergência de micro-organismos resistentes. Os métodos tradicionais de descoberta de antibióticos não foram capazes de acompanhar a evolução dessa resistência, fato que alertou para a necessidade de desenvolvimento de novos agentes antimicrobianos. Os peptídeos antimicrobianos (PAM) derivados de animais e plantas têm sido amplamente estudados como substitutos dos compostos antimicrobianos convencionais. A maioria dos PAMs atua ao nível da membrana plasmática do micro-organismo, interferindo na sua estrutura e permeabilidade, mecanismo o qual previne que o micro-organismo alvo desenvolva resistência ao peptídeo. A pele de anuros (sapos, pererecas e rãs) é uma generosa fonte de PAMs citolíticos de amplo espectro, os quais defendem o animal contra infecções e ingestão por predadores. O objetivo deste estudo foi identificar e caracterizar peptídeos antimicrobianos da pele de Hypsiboas semilineatus, anuro endêmico da Mata Atlântica, Brasil. A sequência de aminoácidos de um novo peptídeo antimicrobiano derivado de Hypsiboas semilineatus foi identificada por ferramentas de clonagem molecular e quimicamente sintetizada. Análises estruturais e físico-químicas revelaram que o PAM sintético, nomeado Hs-1, consiste de uma cadeia linear de 20 resíduos de aminoácidos (FLPLILPSIVTALSSFLKQG) a qual se estrutura em uma alfahélice com 2 caudas terminais. Hs-1 tem um peso molecular de 2.144,6 Daltons, pI teórico de 8,75, carga líquida +1 e média total de hidrofobicidade 1,275. As concentrações inibitórias mínimas de Hs-1 foram determinadas pelo método de microdiluição padrão e identificadas como a menor concentração do peptídeo na qual nenhum crescimento visível foi observado. O peptídeo Hs-1 inibiu o crescimento de todas as bactérias gram-positivas analisadas, com um intervalo de ação de 11-46μM, mas não apresentou efeitos detectáveis contra nenhuma bactéria gram-negativa, o que sugere que Hs-1 possa ter uma ação seletiva para bactérias gram-positivas. Nas mesmas concentrações, Hs-1 não apresentou efeito citotóxico sobre eritrócitos humanos ou leucócitos. Os mecanismos de ação de Hs-1 foram investigados por microscopia eletrônica de transmissão e as imagens obtidas sugerem que Hs-1 possue um efeito bactericida direto, provavelmente por agir ao nível da membrana celular. Estas propriedades qualificam Hs-1 como uma molécula anfipática de bom potencial terapêutico. Mais estudos envolvendo o peptídeo Hs-1 serão necessários para a melhor caracterização de suas propriedades e ações biológicas e para que, finalmente, sua inicialização em ensaios clínicos seja considerada.

Antibiotics have revolutionized the treatment of infectious disease because they inhibit specific process that are essential for bacterial life but the indiscriminate and extensive use of these antibacterial agents have also introduced a selective pressure and consequent emergence of resistant pathogens. Traditional methods of antibiotic discovery have failed to keep pace with the evolution of this resistance, which suggests that new antimicrobial agents may be required. The antimicrobial peptides (AMPs) derived from animals and plants have been extensively researched as substitutes for currently used antimicrobial compounds. Most of the AMPs kill microorganisms rapidly by disrupting and permeating the microbial membrane, mechanism that prevents a target organism from developing resistance to the peptide. The anurans skin (frogs and toads) is a generous source of broadspectrum cytolytic AMPs, which defend the animal against infections and also protect from ingestion by predators. The objective of this study was to identify and to characterize antimicrobial peptides of the skin of the frog Hypsiboas semilineatus, endemic to Atlantic Forest, Brazil. By molecular cloning tools the amino acid sequence of one new antimicrobial peptide from Hypsiboas semilineatus was identified and it was chemically synthesized. The structural and physiochemical analysis of the synthetic AMP, named Hs-1, revealed that it consists of a linear polypeptide chain of 20 amino acid residues (FLPLILPSIVTALSSFLKQG) forming an alpha-helix with 2 terminal tails. Hs-1 has a molecular weight of 2,144.6 Daltons, theorical pI of 8.75, GRAVY of 1.275 and net charge +1. Minimum Inhibitory Concentrations of Hs-1 were determined by a standard microdilution method and were taken as the lowest concentration of peptide where no visible growth was observed. The peptide Hs-1 inhibited the growth of all gram-positive bacteria analysed, with a range of 11-46μM, but it didn t show effect against any gram-negative bacteria, which suggest that Hs-1 may have a selective action for gram-positive bacteria. In this same concentration Hs-1 did not show any cytotoxic effect over human erythrocytes or Leukocytes. The mechanisms of action of Hs-1 were investigated by transmission electron microscopy and the images obtained suggest that Hs-1 has a direct bactericidal effect probably for acting at membrane level. These properties qualify Hs-1 as an amphipathic molecule with good therapeutic potential. Further studies involving peptide Hs-1 will be needed to better characterize their properties and biological actions, and to finally discern about its startup in clinical trials.