Aprimoramento do diagnóstico de Leishmaniose visceral canina por ELISA usando o antígeno NTPDase-2 de Leishmania (Leishmania) infantum chagasi e padronização do diagnóstico por imunocromatografia

Abstract

A leishmaniose visceral canina (LVC), causada pela Leishmania infantum chagasi é foco de diversos estudos, devido à relevância do cão como reservatório. No Brasil, a eutanásia de cães infectados é usada como controle da doença, orientada pelas técnicas de RIFI e ELISA. Porém estas técnicas apresentam limitações, que justificam o aprimoramento do diagnóstico. Em um trabalho prévio do nosso grupo, a proteína recombinante NTPDase-2 de L. infantum chagasi foi usada como antígeno em ensaios de ELISA, mostrando bom potencial para esta aplicação. O objetivo deste trabalho foi aprimorar o diagnóstico por ELISA. Para isto, foi feita a purificação manual e automatizada (FPLC). As purificações manuais forneceram maior grau de pureza e o processo em FPLC forneceu maior rendimento. Assim, várias purificações foram testadas, a fim de obter alto grau de pureza em sistema automatizado. Novos ELISAs foram realizados usando diferentes quantidades de antígeno (0,1 – 0,5 µg), diferentes diluições do soro de cães positivos e negativos (1:40; 1:80 e 1:160) e diferentes substratos de desenvolvimento de cor (TMB e OPD) para revelação. A influência da conformação do antígeno foi avaliada usando-o em condição nativa ou desnaturada. Na padronização do ELISA, 0,1 µg de antígeno e diluição do soro 1:160 foram as melhores condições. O uso de TMB e OPD não geraram diferenças significativas. Além disto, o antígeno renaturado também não levou à diferença significativa, indicando que o reconhecimento antígeno x anticorpo independente da conformação do antígeno. Quanto às purificações em FPLC, a melhor foi obtida usando 0,5 pellet bacteriano referente a 400 mL de indução, que forneceu grau de pureza de 96,6%. Além disso, foram feitos testes preliminares para a padronização deste antígeno em testes imunocromatográfcos. Foram padronizadas as conjugações da Proteína A e anti-IgG de cão a ouro coloidal de 40 nm. Para a linha controle, foi padronizada a concentração 2,5 µg/µL de IgG de cão na membrana de nitrocelulose e diluição do conjugado de 5x. Nossos dados confirmam que a NTPDase-2 tem potencial para o diagnóstico da LVC e que é possível melhorar os níveis de detecção de anticorpos variando as condições do ensaio. Além disto, foi possível iniciar a padronização de um teste imunocromatográfico que poderá futuramente trazer nova alternativa para o diagnóstico da LVC.

Canine visceral leishmaniasis (CVL), caused by Leishmania infantum chagasi is focus of many studies because the relevance of the dog as reservoir. In Brazil, euthanasia of infected dogs is used as the control the disease, and the diagnosis is guided by ELISA and IFA techniques. However, these techniques are limited, justifying the improvements of diagnosis. In a previous study from our research group, NTPDase-2 recombinant protein of L. infantum chagasi was used as antigen in ELISA assays, showing potential for this application. The objective of this study was improve the diagnosis by ELISA. For this purpose, manual and automated (FPLC) purification were performed. The manual purification offered higher purity and the process in FPLC provided higher yield. Thus, several purifications were tested, in order to obtain high level of purity in FPLC. New ELISAs were performed varying the antigen amounts (0.1 to 0.5 µg), dilutions of the serum of positive and negative dogs (1:40, 1:80 and 1: 160) and substrates system OPD and TMB. To evaluate the influence of antigen conformation, native or denatured condition were tested. The standardization of the ELISA, shown best results when 0.1 µg antigen and serum dilution 1: 160 were used. TMB and OPD did not shown significant differences. Furthermore, the refolded protein was not more effective than the denatured protein, indicating that recognition of the antigen: antibody is preferably not dependent of antigen conformation. The purification on FPLC, the better was obtained using 0.5 bacterial pellet was related to the 400 ml of induction, which provided a high purity (96.6%). In addition, preliminary tests to standardize immunochromatographic test were made using the dot blot. Conjugations of Protein A and anti-dog IgG to colloidal gold 40 nm were standardized. For the control line has been standardized concentration 2.5 µg/µl of dog IgG on the nitrocellulose membrane and conjugate dilution 5 times. Our data confirm that NTPDase-2 antigen has potential to be used on the diagnosis of CVL and it is possible to improve the detection of antibodies levels, varying the conditions of the assay. Furthermore, it was possible to start the standardization of immunochromatographic test, which can eventually bring new alternative for the diagnosis of CVL.