Ciências Biológicas e da Saúde
URI permanente desta comunidadehttps://locus.ufv.br/handle/123456789/3
Navegar
Item Análise da expressão gênica e perfil metabólico de carrapatos Amblyomma sculptum infectados com Rickettsia amblyommatis(Universidade Federal de Viçosa, 2021-05-25) Araujo, Fernanda Sales de; Siqueira, Cláudio Lísias Mafra de; http://lattes.cnpq.br/0488404328765810Os carrapatos são artrópodes parasitas hematófagos, pertencentes à ordem Acari e distribuídos em três famílias: Ixodidae, Argasidae e Nuttalliellidae. Espécie comumente encontrada do sul dos Estados Unidos ao norte da Argentina, o Amblyomma sculptum pertence à família Ixodidae. O gênero Rickettsia pode permanecer no intestino, ovário, hemocele e glândulas salivares, dentre os patógenos que infectam carrapatos, pulgas e piolhos. Os carrapatos são capazes de manter estas bactérias por várias gerações, as quais possuem um sistema metabólico limitado, dependendo de intermediários adquiridos por quando da hematofagia e suas reações metabólicas. Para análise do peso, número de cópias de bactéria, e expressão de enzimas-chave do metabolismo utilizando a reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa, carrapatos fêmeas A. sculptum foram alimentados com sangue, sangue adicionado de células VERO, e sangue adicionado de células VERO infectadas com Rickettsia amblyommatis, durante 12, 24, e 48 horas. Outro grupo foi alimentado com os mesmos tratamentos por 48 horas para análise do perfil metabólico utilizando a cromatografia gasosa acoplada ao espectrômetro de massas e os aplicativos TargetSearch e Metaboanalyst. Verificamos no intestino médio dos carrapatos infectados que o número de cópias da bactéria apresentou um aumento significativo de 24 para 48 horas. Nos tratamentos não infectados, a diferença de peso após a alimentação revelou um aumento de massa. Na presença de riquétsia, verificou-se diminuição ou não aumento do peso. Na análise da expressão relativa, enzimas escolhidas da via glicolítica, ciclo do ácido tricarboxílico, fosforilação oxidativa, beta-oxidação, transporte de ácidos graxos e dos metabolismos de aminoácidos e nucleotídeo foram alteradas quando da presença da bactéria nos diferentes tempos de alimentação. Diversos compostos identificados na análise do perfil metabólico estavam envolvidos no metabolismo de aminoácidos, purina, pirimidina, carboidratos, ciclo do ácido tricarboxílico, lipídeos, ácidos graxos, nicotinato, nicotinamida e pentose fosfato. Com a elucidação do nível de expressão das enzimas-alvo e a abundância dos metabólitos identificados, demonstramos com mais detalhes que diversas vias são alteradas e direcionadas para o favorecimento de componentes essenciais para a sobrevivência e manutenção da riquétsia no intestino médio dos carrapatos ou resposta protetiva contra o patógeno. Estudos posteriores permitirão avançar nestes conhecimentos, potencialmente contribuindo para uma melhor compreensão da relação parasito- hospedeiro, selecionando novos alvos para o controle destes agentes e na bioprospecção de novas moléculas. Palavras-chave: Amblyomma sculptum. Rickettsia amblyommatis. Metabolismo.Item Avaliação de antivirais contra Acute bee paralysis virus e avaliação da infecção de Apis mellifera sob diferentes temperaturas(Universidade Federal de Viçosa, 2019-07-12) Dutra, Luana Lucas; Mendes, Tiago Antônio de Oliveira; http://lattes.cnpq.br/3622983125581425As abelhas ocidentais Apis mellifera são animais de grande valor econômico e ambiental. Sua importância se dá principalmente pelo serviço de polinização, tanto de espécies vegetais silvestres quanto de culturas agrícolas de valor comercial. Nos últimos anos tem ocorrido grandes perdas em colônias ao redor do mundo. Mortes massivas após rigorosos invernos e o desaparecimento de operárias, sem uma ameaça aparente, tem chamado a atenção de pesquisadores e governos. Não existe uma causa específica para estas perdas, trata-se da ação conjunta de fatores como patógenos, mudanças climáticas, nutrição e exposição à pesticidas. Dentre estes fatores destaca-se o Acute bee paralysis virus (ABPV). Este patógeno é transmitido pela saliva e fezes dentro da colônia e normalmente provoca uma infecção assintomática. Porém, em altas concentrações o ABPV se torna altamente letal, provocando tremores, escurecimento, paralisia e morte de operárias em poucos dias. A presença do ácaro Varroa destructor está associada a infecções sintomáticas de ABPV, dado que o ácaro transmite este vírus diretamente na hemolinfa da abelha através da mordida. Assim, neste trabalho foram avaliadas as mudanças fisiológicas provocadas pelo ABPV sob diferentes temperaturas e propôs-se um antiviral sintético capaz interromper a multiplicação viral. Observou-se que a defesa do hospedeiro contra o ABPV não é mediada pela imunidade humoral ou celular. Abelhas infectadas sob à temperatura normal da colônia (32 ±2ºC) apresentaram maior expressão de ABPV, porém as alterações fisiológicas características da infecção por Dicistrovírus foram observadas no grupo infectado a uma temperatura subótima (26 ±2ºC). Observou-se ainda maior expressão de proteínas da via de choque térmico (HSP) no grupo a 32 ±2ºC, o que indica que a maior concentração do vírus nesta temperatura foi resultado do metabolismo mais ativo do hospedeiro e que a resposta antiviral pode ser mediada por HSPs. Para a busca por um antiviral contra o ABPV utilizou-se o modelo estrutural da cisteíno protease produzida pelo vírus como alvo para potenciais inibidores. A estrutura do alvo foi construída computacionalmente e, após a triagem de 175 moléculas, foram selecionados os cinco ligantes que apresentaram melhor afinidade pelo sítio ativo da enzima. Após o tratamento de operárias infectadas artificialmente com estas moléculas, classificadas como xantenonas, o Composto 2 apresentou significativa redução da expressão do vírus. Além disso, observou-se que proteínas envolvidas no transporte vesicular de neurotransmissores são down-reguladas na presença do vírus. Esta alteração fisiológica não foi observada após o tratamento com o Composto 2, que também aumentou o metabolismo energético da abelha. Assim, neste trabalho foram obtidas novas informações sobre a infecção por ABPV e as alterações que ele provoca no hospedeiro. O antiviral proposto apresentou resultados promissores e estudos futuros serão necessários para confirmar o mecanismo de ação.Item Caracterização das Modificações Pós-Traducionais das Proteínas Cristalinas Alfa, Beta e Gama do Cristalino de Felis catus(Universidade Federal de Viçosa, 2019-07-01) Oliveira, Angelo Bruno Nunes; Siqueira, Cláudio Lísias Mafra de; http://lattes.cnpq.br/0323455093325673Existe o consenso na literatura veterinária de que a incidência de catarata em gatos é geralmente menor do que em cães e em outros mamíferos. Contudo, os estudos moleculares das proteínas do cristalino de gatos, por serem escassos, não explicam essa diferença de incidência. Neste sentido, iniciamos estudos proteômicos do cristalino de gatos saudáveis a fim de caracterizar as proteínas mais abundantes. No geral, observa-se que as cristalinas alfa, beta e gama são as principais e mais abundantes proteínas encontradas no cristalino da maioria das espécies animais, chegando a cerca de 90% do total de proteínas de cada célula fibrosa, em mamíferos, sendo as responsáveis pela manutenção do correto índice de refração da luz no cristalino. Considerando-se que estas proteínas devem permanecer funcionais durante toda a vida do indivíduo, sem ciclo de troca ou renovação, e expostas ao estresse luminoso por tempo similar, modificações pós- traducionais ocorrerão nas cristalinas afetando sua função. Neste estudo, utilizou-se a abordagem bottom-up de análise proteômica para a identificação de modificações pós- traducionais em cristalinos saudáveis de gatos. Foram identificadas 13 cristalinas, com 44 modificações pós-traducionais em um total de 1.117 posições (sítios). Dentre as modificações mais frequentes destacaram-se as acetilações e fosforilações nas cristalinas alfa e as desamidações, que apresentaram algumas diferenças quanto à presença em relação à literatura. A identificação e caracterização das modificações pós-traducionais que ocorrem nas proteínas das famílias Cristalinas em Felis catus, contribuem como base para futuros estudos que busquem um melhor entendimento dos aspectos quanto a menor susceptibilidade do cristalino de gatos à catarata.Item Efeito das variações de temperatura na expressão gênica no intestino médio de Aedes aegypti e suas implicações para a interação com Zika virus(Universidade Federal de Viçosa, 2022-01-27) Ferreira, Priscila Gonçalves; Mendes, Tiago Antônio de O.; http://lattes.cnpq.br/3798340525141253The continuous discovery of new pathogens and the emergence of new transmission forms reveal a constant threat to public health. Added to that, climate change can to be an aggravating factor on pathogen transmission. Vector-borne infections represent a major public health challenge and however, we are only just beginning to understand the complexity underlying mosquito–pathogen interactions and how abiotic factors, as temperature affect these interactions. To understand better the temperature effects on vector physiology and its effects on mosquito-pathogen, we compared the transcriptome of mosquito midgut samples from mosquitoes exposed to Zika virus (ZIKV) and non-exposed mosquitoes housed at three different temperatures (20, 28, and 36°C) during 24 and 48 hours of exposure. Initially, the quantification of viral RNA copy number does not show difference between 24 and 48 h post-exposure at 20°C, suggesting that ZIKV replication is limited by cold-induced changes to the mosquito midgut environment. Genes encoding proteins involved in blood digestion, ROS metabolism and mosquito immunity were the ones that showed the greatest change in expression at 20ºC. From these results, we hypothesize that temperature variation affects the blood digestion process, modulating the generation of reactive oxygen species (ROS) in the midgut. We show that temperature variation affects both the expression of genes involved in blood digestion and the rate of digestion. Additionally, due to temperature effects on ROS levels and the expression of antioxidant proteins in the midgut, lower temperatures (20°C) result in a longer state of oxidative stress when compared to other temperatures (28 and 36°C). Finally, alternative splicing events were investigate under different temperatures. Interestingly, among listed genes, we found Trypsin (TRY), Ferritin (FER), Thioredoxin (TRX) and Peptidoglycan recognition protein LC (PGRP-LC), genes previously shown to have their expression modulated by temperature. Our results reveal the physiological processes that are impacted by temperature variation and suggest how the immune response is modulated against Zika virus infection.Keywords: Aedes aegypti. Temperature. Zika virus. Transcriptome. Alternative Splicing.Item Estudo da variabilidade e organização de genes que codificam proteínas de superfície de cepas de Staphylococcus aureus associadas à mastite bovina(Universidade Federal de Viçosa, 2021-12-16) Rocha, Lis Souza; Ribon, Andrea de Oliveira Barros; http://lattes.cnpq.br/6648940980655820Estudo da variabilidade e organização de genes que codificam proteínas de superfície de cepas de Staphylococcus aureus associadas à mastite bovina. Orientadora: Andréa de Oliveira Barros Ribon. Coorientador: Tiago Antônio de Oliveira Mendes. Staphylococcus aureus é um importante patógeno causador de mastite bovina em rebanhos de gado leiteiro. A doença, que acomete os quartos mamários de vacas leiteiras, é de alta prevalência, difícil tratamento, e pode evoluir para quadros mais graves afetando o bem-estar animal, e reduzindo a rentabilidade dos produtores. A doença pode se manifestar de forma clínica, com sinais inflamatórios sistêmicos visíveis, ou de forma subclínica, sem sintomas aparentes exceto pelo aumento da alta contagem de células somáticas no leite. Diversos estudos têm tentado entender os mecanismos moleculares associados pelos quais cepas de S. aureus, promovem invasão, evasão e modulação do sistema imune de seus hospedeiros. Neste trabalho, foi realizada a comparação de proteínas de superfície e secretadas de cepas de S. aureus visando identificar fatores bacterianos associados à mastite clínica ou subclínica. No Capítulo 1, análises in silico realizadas com as cepas bovinas 302, 170, 1269, 1364, (subclínicas), RF122 e N305 (clínicas) mostraram a alta similaridade em relação ao conteúdo de genes de virulência e reguladores. No entanto, vários polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) não sinônimos foram identificados, especialmente em genes que codificam proteínas envolvidas na evasão imune do hospedeiro e proteínas de superfície. Uma lipoproteína foi identificada como exclusiva de bactérias pertencentes ao grupo clínico. No Capítulo 2, bactérias coletadas em cinco estados brasileiros foram usadas para validar os achados do Capítulo 1. O gene da lipoproteína foi amplificado a partir do DNA total de 108 isolados com um par de primers complementares apenas à sequência encontrada nas cepas clínicas N305 e RF122. Os resultados mostraram um amplicon do tamanho esperado em 34/38 (89,47%) isolados de mastite clínica, e em apenas 3/34 (8,82%) isolados de mastite subclínica. No Capítulo 3, foi estudada a organização do cluster lpl, região do genoma de S. aureus onde se localiza o gene que codifica a lipoproteína identificada no Capítulo 1, visando elucidar os mecanismos com os quais uma lipoproteína de membrana pode interferir na forma como Staphylococcus aureus de manifesta como um patógeno bacteriano de grande importância internacional. Análises in silico mostraram diferenças no C-terminal da lipoproteína, região implicada na internalização bacteriana.Em resumo, este trabalho identificou que, a despeito da alta similaridade no conteúdo gênico de cepas bovinas de S. aureus, existem diferenças em lipoproteínas que podem influenciar o processo de infecção da glândula mamária. Palavras-chave: Staphylococcus aureus. Mastite bovina. Fatores de virulência. Lipoproteína. Cluster lpl.Item Leishmania infantum chagasi: estudo da atividade enzimática de uma Nucleotídeo Trifosfato Difosfohidrolase-2 (NTPDase-2) e clonagem de uma possível Serine/Arginine Protein Kinase (SRPK).(Universidade Federal de Viçosa, 2019-02-28) Abreu, Emílio Santana de; Vasconcellos, Raphael de Souza; http://lattes.cnpq.br/4408181234461761A leishmaniose é uma doença causada por protozoários do gênero leishmania sendo transmitidas por flebotomíneos. A doença pode se manifestar com lesões na pele e mucosas do indivíduo infectado ou pode atingir órgãos internos (leishmaniose visceral). A Leishmania infantum chagasi é um dos protozoários causadores de leishmaniose visceral com importante manifestação no Brasil. Neste contexto, o estudo de enzimas quinases como alvos de ação de medicamentos proporciona meios racionais para a pesquisa de novas drogas. Neste trabalho foram estudadas duas enzimas, uma apirase, NTPDase-2 e uma quinase SRPK de L. infantum chagasi. O objetivo deste estudo é padronizar a renaturação da LicNTPDase-2 e avaliar a atividade da enzima frente a diferentes nucleotídeos (ADP, UDP, GDP e ATP), verificar melhor atividade frente a diferentes pHs, temperaturas de 25ºC e 37ºC e verificar variações de sua estabilidade utilizando thermal shift. Também foi realizada a clonagem da SRPK de Leihsmania infantum chagasi para a realização de estudos bioquímicos e biológicos. Assim, neste estudo foi possível identificar que os tampões de 3, 4, 5 e 6 apresentaram melhora atividade enzimática, comparado com os tampões 1, 2 e 7, após 24 horas de renaturação de 2 ºC a 8 ºC. Dentre os tampões o tampão 4 apresentou o maior shift. Não ocorreu diferença significativa nos testes realizados a 25ºC e a 37ºC, assim como no teste para avalição de pH. Para as análises de nucleotídeos o UDP, GDP e ADP apresentaram melhora na atividade quando comparados com o ATP. Foi possível realizar a clonagem de LicSRPK predita nas análises de bioinformática em Leishmania infantum chagasi, sendo importante agora a realização de sequenciamento e ampliação de seus estudos.Item O papel dual de AtbZIP60 e AtbZIP9 como moduladores das vias de estresse no retículo endoplasmático e estresse osmótico(Universidade Federal de Viçosa, 2019-07-29) Simoni, Eduardo Bassi; Reis, Pedro Augusto Braga dos; http://lattes.cnpq.br/9175550320573556O desenvolvimento e adaptação de plantas a condições ambientais é altamente correlacionado com a regulação da expressão gênica. Sobre condições de estresse, eventos celulares são desencadeados no intuito de restabelecer a homeostase celular. Da mesma forma, a via de resposta a proteínas mal dobradas (UPR) é caracterizada como sendo um mecanismo celular citoprotetor essencial a respostas aos estresses bióticos e abióticos, os quais são capazes de alterar a homeostase do retículo endoplasmático (RE). Mediante qualquer perturbação no RE que cause acumulo de proteínas mal dobradas em sua porção luminal, os receptores acoplados ao RE são ativados e desencadeiam a sinalização da via UPR. Uma vez ativada, essa cascata de sinalização promove o aumento da expressão de genes relacionados com o dobramento e a degradação de proteínas. Entretanto, em condições de estresse prolongado, a resposta de defesa não é capaz de restaurar o equilíbrio, dessa forma, vias de morte celular programada (PCD) são ativadas. A via NRP/DCD (Asparagine- Rich Protein/Development and Cell Death), uma via de morte celular programada mediada por proteínas ricas em asparagina, é responsiva e conecta sinais de estresse no RE e estresse osmótico. Embora esta via seja conservada entre as espécies, o mecanismo molecular não é totalmente caracterizado, assim como seus componentes. Além de seu papel essencial na via UPR, a chaperona molecular BiP modula negativamente a via de morte celular mediada por proteínas NRP/DCD. Com intuito de elucidar o mecanismo molecular da referida via de resposta a estresses e seus moduladores, AtbZIP60 e AtbZIP9 foram os alvos de estudos deste trabalho. Bem caracterizada como uma proteína da via UPR, bZIP60 apresenta duas isoformas que, consequentemente, podem apresentar respostas alternativas em condições de estresse distintas. Ao contrário de bZIP60, bZIP9 é pouco caracterizado em relação a sua função molecular e suas interações na célula com outras moléculas. Portanto, nós investigamos como bZIP60 e bZIP9 são modulados sobre condições de estresse osmótico e no RE, assim como o papel desses fatores de transcrição (FT) na via de morte celular programada mediada por proteínas NRP/DCD. Nós avaliamos como esses genes respondem a tratamentos com PEG (polietilenoglicol) e TUN (tunicamicina) em plântulas Col-0 (Columbia) de Arabidopsis. Ambos os genes apresentaram um aumento de expressão em resposta a ambos os estresses. Os FT bZIP usualmente atuam como dímeros, homodímeros ou heterodímeros, dessa forma, nós avaliamos se bZIP9 interage com bZIP60 ou se é capaz de formar homodímero. Não foi possível realizar a abordagem de duplo-híbrido em leveduras devido a capacidade de auto-ativação de ambos os FT. Interessantemente, através do ensaio BiFC (complementação bimolecular de fluorescência) nós identificamos que bZIP9 pode formar homodímeros assim como interagir com bZIP60, sendo que, a interação foi intensificada quando as plantas foram tratadas com o indutor TUN. Devido a interação dos FT e o aumento de suas expressões em condições de estresse no RE e osmótico, nos perguntamos se essa expressão elevada em Arabidopsis poderia promover tolerância a estresse osmótico e no RE. Nós observamos uma resposta dual de bZIP9 e bZIP60 perante ambos os estresses. Linhagens superexpressando bZIP9 e bZIP60 foram mais tolerantes a condições de seca quando comparadas com Col-0 ou com a linhagem nocaute de bZIP60 (bzip60). Essas linhagens superexpressando os FT apresentaram fenótipo turgido, alto conteúdo relativo de água durante o estresse, assim como uma maior taxa de sobrevivência após a reidratação. Apesar disso, sobre condições prolongadas de estresse no RE, as mesmas linhagens apresentaram um fenótipo de clorose mais proeminente quando comparados com Col- 0 e bzip60. Além disso, nós avaliamos a influência dos FT na via de morte celular mediada por proteínas NRP desencadeada por estresse no RE. Linhagens superexpressando bZIP9 e bZIP60, Col-0 e bzip60 foram induzidas com TUN. A linhagem bzip60 não mostrou indução de NPR1, enquanto o gene NRP2 foi reprimido nessa condição. Entretanto, as linhagens superexpressando os FT mostraram um aumento na expressão de NRP1 quando comparado com Col-0 e bzip60. Nós também avaliamos a influência da superexpressão de NRP/DCD na expressão gênica de bZIP9 e bZIP60. Transformamos protoplastos com vetores carreando os genes NRPs e avaliamos a resposta após 8h de indução. A superexpressão de NRP1 e NRP2 estimulou positivamente a expressão dos FT. De acordo com tudo que foi mencionado, os resultados mostraram que bZIP9 e bZIP60 estão envolvidos em respostas a estresse osmótico e no RE, assim como modulam os genes NRP/DCD e são induzidos por eles. Experimentos adicionais são necessários para a compreensão do mecanismo desses FT em respostas a estresses.Item Proteômica e metabolômica da soja: mecanismos moleculares da resistência à Anticarsia gemmatalis(Universidade Federal de Viçosa, 2018-02-28) Arrieta, Jenny Dimelza Gómez; Oliveira, Maria Goreti de Almeida; http://lattes.cnpq.br/0224021945625552A cultura da soja (Glycine max (L.) Merrill) é umas das mais importantes para a economia do Brasil sendo o segundo maior produtor e exportador mundial. As grandes lavouras de soja, porém, encontram-se expostas a estresses bióticos como o desfolhamento ocasionado por insetos-praga como Anticarsia gemmatalis, que diminuem a produtividade. O manejo integrado de pragas no Brasil, inclui o uso de pesticidas que podem afetar o equílibro dos ecossistemas, controle biológico e melhoramento genético para produção de plantas resistentes, mas pouco se conhece sobre as características moleculares de resistência delas. O objetivo deste trabalho foi aprofundar no conhecimento sobre os mecanismos moleculares de defesa da soja em plantas susceptíveis e resistentes a insetos praga, e aplica-lo para determinar o efeito na biologia de A. gemmatalis. Neste trabalho foram aplicadas várias estratégias metodológicas, em busca de escolher a variedade com melhor resistência, como as análises de sobrevivência durante a fase larval de A. gemmatalis em plantas de soja UFV TN 105 AP e “IAC PL1” (susceptíveis) e IAC 17, “IAC 19” e IAC 24 (resistentes). Para avaliar o efeito dos compostos produzidos pelas plantas na sobrevivência dos insetos, prepararam-se extratos metanólicos, os quais foram liofilizados, se adicionaram às dietas dos insetos para fazer analises de sobrevivência, e se analisaram os flavonoides por LC-MS. As respostas fisiológicas e bioquímicas das plantas foram comparadas entre genótipos. Para isso foram feitos análises de fito-hormônios, metabôlomica e proteômica nos extratos das plantas. Os resultados mostraram que o genótipo IAC 17 teve as melhores caraterísticas de resistência. Os extratos das plantas tem efeito negativo no desenvolvimento das lagartas, afetam as enzimas intestinais e ocasionam dano neste tipo de células. As análises dos flavonoides mostraram que os genótipos têm diferenças em alguns flavonoides como a genisteína, a quercetina, o kaempferol e seus conjugados. A proteômica mostrou que houve diferenças no proteoma quando as plantas foram expostas à infestação. O proteoma no geral foi muito semelhante entre variedades. Algumas das mudanças no proteoma em 8 viesposta ao inseto entre os genótipos foram as mesmas, mas a grande maioria das proteínas que tiveram abundancia diferencial foram únicas para cada genótipo. A resposta fito- hormonal das plantas à presença da lagarta não variou muito durante os diferentes tempos avaliados, mas entre as variedades existem diferenças nas concentrações dos fito- hormônios avaliados. Fito-hormônios como o acido salicílico tiveram concentrações maiores nos genótipos resistentes e o acido jasmónico nas susceptíveis, mostrando que não todas as respostas de resistência estão relacionadas ao ácido jasmônico. As análises de metabôlomica mostraram um aumento dos metabólitos como o eriodictiol e secologanina, relacionados com defesa depois de 24h de infestação, e mudanças no metabolismo primário. A analise de PCA mostrou uma distribuição diferenciada dos dados às 24h de infestação. As plantas de soja podem ser fontes viáveis para o controle de pragas porque contêm compostos com caraterísticas de bioativos. A defesa de plantas de soja se compõe de uma rede complexa de vias, este estudo mostrou que as caraterísticas obedecem a defesa constitutiva, que pode conduzir a antibiose e tolerância da soja às pragas. O genótipo IAC 17 tem as melhores caraterísticas de resistência à herbívoria, seguido do IAC 24, mostrando ter caraterísticas de antibiose e tolerância. As plantas caracterizadas como suscetíveis e usadas neste estudo também apresentam respostas á herbívoria, mas não o suficiente para causar dano significativo à lagarta-da-soja.Item Rede de interação proteína-proteína na relação entre Rickettsia amblyommatis e células do intestino e ovário de Amblyomma sculptum (Berlese, 1888)(Universidade Federal de Viçosa, 2020-02-21) Dias, Raquel Xavier Ligeiro; Siqueira, Cláudio Lísias Mafra de; http://lattes.cnpq.br/9769358307767560As riquétsias são bactérias intracelulares obrigatórias de hospedeiros vertebrados e invertebrados, diferindo em termos de associação com artrópodes, comportamento dos vetores invertebrados à infecção, na fisiopatologia e desfecho da doença em vertebrados. Entretanto, apesar de saber-se ser o carrapato reservatório e vetor destes microrganismos, os mecanismos moleculares envolvidos na infecção de suas células não foram bem elucidados. Assim, o trabalho teve como objetivo a reconstrução in silico da rede de interação proteína-proteína, a partir de proteínas codificadas do genoma da bactéria Rickettsia amblyommatis e do carrapato Ixodes scapularis. Com o alinhamento das sequências proteicas identificadas, conforme preconizado por diferentes bancos de interações (PSIMAP, iPfam, STRING e PEIMAP), obteve-se uma rede consenso após a normalização dos dados através do cálculo do valor de confiança da interação. Com o auxílio de ferramentas preditivas de localização subcelular, foram selecionadas proteínas de R. amblyommatis com alto potencial de interação com o carrapato e de grande importância para o processo infeccioso, sendo identificadas proteínas secretadas, excretadas e, ou, de superfície. Avaliando a rede de proteínas de membrana predita, foram identificadas 3.546 interações, envolvendo 91 proteínas de membrana da bactéria e 980 proteínas do carrapato. Por ontologia gênica foram identificados os processos biológicos significativos envolvidos na modulação da fisiologia do carrapato pela bactéria. Os módulos encontrados revelaram diferentes vias de sinalização, como, p. ex., secreção, fosforilação de aminoácidos e proteínas e alongamento translacional. Com o intuito de validar a rede obtida, foi realizada a integração dos transcriptomas de intestino e ovário de carrapatos Amblyomma sculptum em resposta à infecção por R. amblyommatis. Com esta estratégia foi possível revelar genes e interações protéicas derivadas de evidências in silico que podem auxiliar estudos adicionais quanto aos mecanismos envolvidos na manutenção e transmissão de riquétsias por carrapatos. Palavras-chave: Rickettsia amblyommatis. Amblyomma sculptum. Interface vetor- patógeno. Interação proteína-proteína. Modelagem molecular e docking.Item Regulação e identificação de componentes a montante da via de sinalização de morte celular mediada por DCD/NRP1.(Universidade Federal de Viçosa, 2019-07-31) Camargos, Luiz Fernando de; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://lattes.cnpq.br/5149825029606209A resposta adaptativa de plantas a condições de estresse é um dos principais desafios na agricultura pois afeta parâmetros de crescimento, desenvolvimento e produtividade. Os estresses abióticos ganham destaque pois estão intimamente relacionados com esses parâmetros, e frequentemente ocorrem simultaneamente no campo, como alterações de temperatura, seca e estresse nutricional. A compreensão de como plantas alteram seu metabolismo em resposta a condições adversas únicas vem sendo analisada intensivamente durante anos, porém há a necessidade de entender como elas se comportariam em resposta a múltiplos estresses. A via de sinalização mediada por DCD/NRP1 é ativada em resposta a diferentes estímulos ambientais, resultando na indução de programas de morte celular derivado de estresses prolongados. Além disso, aumento dos níveis do chaperone molecular BiP atenua a expressão e atividade dos componentes dessa via, promovendo assim uma melhor adaptação de plantas a condições adversas. Na presente investigação, foi demonstrado que uma correlação entre a expressão de DCD/NRP1 com transdutores responsivos a sinais de acúmulo de proteínas mal dobradas, proteína G heterotrimérica, luz e ácido abscísico, indicando um papel chave de DCD/NRP em mecanismos sinalizadores. Posteriormente, procurou-se elucidar os mecanismos que conectam a via de morte celular DCD/NRP com seu modulador negativo BiP que se encontram espacialmente separados dentro da célula. Análise do possível envolvimento de transdutores de sinais presentes na membrana do retículo endoplasmático na ativação da via de morte celular demonstrou que a subunidade β da proteína G (AtAGB1) atua como componente a montante da via de sinalização mediada por DCD/NRP1. Foi demonstrado que os genes componentes da via de morte celular mediada por DCD/NRP requerem AGB1 para indução em resposta a estresse osmótico e do retículo endoplasmático. Além disso, o mutante agb1-3 demonstrou ser mais tolerante a condições adversas de estresse no retículo endoplasmático e por seca, fenótipo revertido em linhagens agb1-3 transformadas ectopicamente com AtAGB1 e intensificado em linhagens superexpressando AtAGB1. Além disso, a expressão de AGB1 em condições de estresse também foi modulada pelo chaperone molecular BiP. Coletivamente esses dados indicam que AGB1 atua como integrante a montante de NRP na via de sinalização que integra sinais de múltiplos estresses em programas de morte celular.Item Tolerância da soja a seca: respostas moleculares da superexpressão da chaperona BiP e da interação com fungo endofítico Pochonia chlamydosporia(Universidade Federal de Viçosa, 2021-10-27) Rodrigues, Juliano Mendonça; Ramos, Humberto J. de Oliveira; http://lattes.cnpq.br/5196583036930660Tolerância da soja a seca: respostas moleculares da superexpressão da chaperona BiP e da interação com fungo endofítico Pochonia chlamydosporia. Orientador: Humberto Josué de Oliveira Ramos. Coorientadores: Elizabeth Pacheco Batista Fontes, Juliana Rocha Lopes Soares Ramos, Maria Goreti de Almeida Oliveira e Leandro Grassi de Freitas. Plantas, por estarem inseridas em um ambiente dinâmico e complexo, estão expostas a diversas mudanças das condições ambientais que podem limitar o seu crescimento e produtividade. Estresses abióticos como escassez hídrica e secas prolongadas são um desafio, uma vez que tendem a se tornar cada vez mais frequentes devido a eventos climáticos extremos. Como maior produtor e exportador mundial de soja, a agricultura brasileira tem um interesse especial nos mecanismos de tolerância cruzada a estresses bióticos e abióticos em soja. Por isso, diversos estudos buscam obter mecanismos de adaptação e resistência vegetal a estresses ambientais com o melhoramento da produtividade agrícola e o mínimo de impacto ao meio ambiente. Uma das linhas de pesquisa visa a manipulação da chaperona molecular BiP em plantas transgênicas, cuja resposta ao estresse osmótico e do retículo endoplasmatico podem favorecer a tolerância à seca em soja. Entretanto, são boladas as informações sobre os efeitos da superexpressão de BiP no atraso na ativação da morte celular provocada por reação de hipersensitividade em situações de estresse biótico provocado pela bactéria não compatível Pseudomonas syringae pv. tomato. Outra linha de pesquisa, o uso de produtos biológicos baseados em organismos simbiontes da rizosfera vegetal que colonizam como raízes vegetais, dentre os quais o fungo nematófago endofítico Pochonia chlamydosporia pode estimular a capacidade da raiz de soja em explorar o solo ao redor favorecendo-a em condições de restrição hídrica. Neste trabalho, foi caracterizado o perfil morfológico, fisiológico e metabólico de genótipos contrastantes de soja quanto à tolerância a seca em resposta a interações bióticas. Foram analisadas a expressão de genes responsivos por RT-PCR, além da regulação diferencial de proteinas e fosfoproteinas responsivas à interação planta-bactéria no genótipo transgênico superexpressando BiP (C9) e (WT), sendo identificado por LC/MS- 2DE. Foram também adotados por LC-MS a abundância de fito-hormônios e alguns metabólitos especializados alvos em resposta à interação de soja com P. syringae pv. tomato e soja com P. chlamydosporia para determinar mudanças metabólicas básicas genótipos relacionados com a resposta à seca e/ou a resposta de defesa vegetal sob interações biológicas.Por sua vez, parâmetros morfofisiológicos de folhas, caule e raiz de genótipos tolerante a seca Embrapa48 e sensível a seca BR16 foram coletados ao longo do experimento planta-fungo. Concluiu-se que a via de síntese de flavonóides e isoflavonóides é uma das principais vias responsivas às inoculações com bactérias e com fungo em plantas, sendo determinante para a presença e contenção do hospedeiro. A resposta hipersensitiva bacteriana provocou uma expressão de genes que modulam a morte celular, sobretudo no genótipo transgênico, uma redução negativa de proteinas da fotossintese e uma regulação positiva de proteinas do metabolismo antioxidativo e do metabolismo dos fenilpropanoides e flavonóides, especialmente O-metiltransferases. Por fim, a interação bacteriana regulou positivamente os níveis de flavonoides e fitoalexinas em genótipos infectados. A presença do fungo, por sua vez, produziu um atraso de um dia na queda do potencial hídrico em ambos os genótipos contrastantes quanto a seca. O aumento do turgor foliar e como mudanças nos níveis de fito- hormônios, poliaminas e compostos fenólicos indicam que uma associação da planta ao fungo nas condições de déficit hídrico é inerente a cada genótipo, sendo que nenhum genótipo é tolerante a seca está ligada às propriedades hidráulicas dos vasos condutores. A presença do fungo promove mudanças morfológicas no sistema radicular e no sistema de vasos condutores da parte aérea em Embrapa48 e, em menor extensão, em BR16. Esses resultados podem ajudar a elucidar os mecanismos predominantes na tolerância cruzada de estresses bioticos e abioticos concomitantes, e como as plantas como utilizam para promover uma maior adaptação ao ambiente. Palavras-chave: Glycine max. Pseudomonas syringae patovar chlamydosporia. Estresses ambientais. Metabolômica. Proteômica. tomato. Pochonia