Bioquímica Aplicada
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Item Produção de xilooligossacarídeos por xilanase fúngica recombinante imobilizada(Universidade Federal de Viçosa, 2022-07-29) Fernandes, Letícia Persilva; Alfenas, Gabriela Píccolo Maitan; http://lattes.cnpq.br/2470609087080753A endoxilanase é uma enzima que hidrolisa a cadeia de xilana formando xilooligossacarídeos (XOS) menores que são ingredientes prebióticos com potencial aplicação nas indústrias de alimentos e farmacêutica. Entretanto, o uso de enzimas na indústria pode ser limitado devido ao seu alto custo; portanto, faz-se necessário o uso de metodologias como a imobilização, que torna possível a recuperação da enzima, sua reutilização e melhora das características físico- químicas enzimáticas, de acordo com o processo desejado. O objetivo deste trabalho foi produzir XOS por uma xilanase fúngica engenheirada imobilizada. Para isso, a xilanase do fungo Orpinomyces sp., SM2, foi expressa em Escherichia coli e, após a expressão, foi realizada a imobilização do extrato bruto diluído 100 vezes pela metodologia de cross-linking com isopropanol 80 % e glutaraldeído 1 %. Então, fez-se o ensaio de pH ótimo, temperatura ótima e a termoestabilidade a 50 ºC, para comparação das formas livre e imobilizada da enzima. Foi aplicado 1 U do agregado enzimático na sacarificação do farelo de arroz pré-tratado alcalinamente com NaOH 1 %. Alíquotas foram coletadas para a avaliação do perfil dos XOS. Por fim, realizou-se o teste de reutilização da enzima imobilizada na temperatura de 50 ºC, por 10 ciclos, e o ensaio de armazenamento por 15 dias em temperatura ambiente e à 4 ºC. O rendimento de imobilização foi de 1,48 %. A enzima imobilizada obteve melhor atividade na faixa de pH ácida para neutra, sendo 5 o seu pH de máxima atividade; enquanto que a enzima livre apresentou melhor desempenho na faixa básica e seu pH ótimo foi 8. A temperatura ótima foi de 60 ºC para as duas enzimas, porém a xilanase imobilizada apresentou melhor estabilidade em uma faixa maior de temperatura. O tempo de meia vida da xilanase SM2 imobilizada foi de 216 horas e o da enzima livre de 30 horas. No ensaio de sacarificação, após 96 horas, houve a produção de 0,903 ± 0,013 g/L de xilobiose, 0,487 ± 0,000 g/L de xilotriose e 0,809 ± 0,006 g/L de xiloexose pela enzima imobilizada. Para o teste de reutilização, a atividade enzimática aumentou a cada ciclo, e no ensaio de armazenamento não houve diferença estatística nas atividades enzimáticas para as duas condições testadas. Portanto, conclui-se que apesar do baixo rendimento de imobilização da xilanase SM2, este processo melhorou a estabilidade da enzima, tornando-a mais estável em temperaturas mais altas, e aumentando o tempo de meia vida para mais de 7 vezes em comparação com a xilanase livre no ensaio de termoestabilidade. Na sacarificação, mesmo com uma concentração baixa de xilanase imobilizada, houve hidrólise do farelo de arroz pré-tratado, com liberação de XOS. Por fim, foi demonstrado que a enzima imobilizada pode ser reutilizada por mais de 10 ciclos, e como não houve diferença entre as duas formas de armazenamento, sugere-se que não há necessidade de refrigeração para manutenção da atividade da xilanase imobilizada. Palavras-chave: Xilanase. Expressão heteróloga. Imobilização. Xilooligossacarídeos.