Bioquímica Agrícola
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Item Regulação do promotor de GmNAC081 durante o desenvolvimento de Nicotiana tabacum e em resposta a estresses abióticos(Universidade Federal de Viçosa, 2014-09-22) Alves, Janaína Roberta; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://lattes.cnpq.br/3842008316794902Os membros da família de fatores de transcrição NAC (acrônimo de NAM, ATAF e CUC) são específicos de plantas e são conhecidos por atuarem tanto no desenvolvimento quanto na regulação da resposta a estresse. Dentre os genes NAC envolvidos em respostas contras estresses bióticos e abióticos já identificados em soja (Pinheiro et al., 2009, Le et al., 2011),o gene GmNAC081 é induzido pela expressão de NRPs (Faria et al., 2011) e por diferentes condições de estresses fisiológicos (Pinheiro et al., 2009) portanto, é possível que elementos em cis presentes no seu promotor promovam a integração de diferentes sinais que resultem em morte celular mediada por GmNAC081.A presente investigação teve como objetivos principais confirmar a presença de domínios discretos no promotor do gene GmNAC081 responsivos a estresses osmótico, induzido por PEG, e do retículo endoplasmático, induzido por tunicamicina e avaliar a expressão basal e tecido- específica do promotor em condições de cultivo in vitro e em casa de vegetação. Além disso, foi avaliado a atividade do promotor GmNAC081 durante o desenvolvimento. Para isso, foram utilizadas plantas transgênicas contendo o promotor GmNAC081 na extensão de 1000 pb, 750 pb e 500 bp fusionadas ao gene repórter GUS. Análises fluorimétricas quantitativas de GUS revelaram a presença de elementos em cis responsivos a PEG na regiao contida pelas posições -1000 a -750. Pelo menos dois elementos responsivos a tunicamincina devem estar contidos nas regioes -1000 a -750 e -750 a -500. Os resultados da presente investigação revelaram que a atividade do promotor de 1000pb de GmNAC081 está relacionada às condições de cultivo de plantas trangênicas de Nicotiana tabacum, sendo fortemente induzido durante a senescência. Estes resultados foram confirmados por meio de análises histoquímicas. De fato, a região 5’ de -1000pb que flanqueia o gene GmNAC081 é induzível por estresses osmótico e do retículo endoplasmático em diferentes orgãos e tecidos (Rosado, 2012). As sequências de 1000pb do promotor de GmNAC081 foram capazes de direcionar a expressão de GUS no tecido vascular em plantas cultivadas in vitro. Além disso, as análises histoquímicas de atividade de GUS confirmaram que o promotor de GmNAC081 é fortemente induzido em tecidos em estádios avançados de desenvolvimento. Coletivamente, estes resultados demonstram que a inducão do gene GmNAC081 por estresses e durante a senescência ocorre no nível transcricional por meio de elementos cis-regulatórios presentes em regiões discretas do promotor. Além disso, os resultados de atividade do promotor GmNAC081 substanciam o argumento de que GmNAC081 esteja envolvido em resposta a estresse e no processo de senescência natural.Item Caracterização funcional do fator de transcrição GmbZIPE2 de soja (Glycine max)(Universidade Federal de Viçosa, 2014-07-23) Gonçalves, Amanda Bonoto; Fietto, Luciano Gomes; http://lattes.cnpq.br/9080276580537208Na interação planta/patógeno, a modulação da transcrição gênica é fundamental para montar uma resposta de defesa eficaz nas células do hospedeiro.Os fatores de transcrição estão entre os principais alvos em plantas para o aumento da tolerância a estresses, uma vez que estas proteínas controlam a expressão de vários genes ao mesmo tempo. Membros da família de fatores de transcrição bZIP podem atuar na defesa contra patógenos. Apesar da função de bZIPs na defesa contra patógenos ser conhecida, poucos trabalhos caracterizaram bioquimicamente membros dessa família que participam de vias de defesa. O GmbZIPE2 (Glyma05g30170.1) é um membro do grupo E da família bZIP de soja, que é responsivo à infecção por Phakopsora pachyrhizi. Esse trabalho teve como objetivo principal caracterizar funcionalmente o transfator GmbZIPE2, mapeando cis-elementos que ele se liga, bem como genes responsivos a GmbZIPE2. A proteína GmbZIPE2 foi capaz de se ligar ao H-box, cis-elemento que é relacionado a patógenos. GmbZIPE2 induz genes de vias importantes para a defesa da planta, como CHS15-6 e PR-1. GmbZIPE2 reprime ANK1, um regulador negativo de morte celular. Os resultados desse trabalho indicam uma relação do fator de transcrição GmbZIPE2 na defesa da planta contra o ataque de patógenos. Maiores conhecimentos sobre o GmbZIPE2 pode contribuir com o conhecimento acerca da resposta da planta a estresse biótico e poderá ser útil para a obtenção de novos alvos para a modificação genética de cultivares.Item Caracterização molecular e biológica do begomovírus Soybean chlorotic spot virus e construção de um vetor de silenciamento baseado na modificação de seu genoma(Universidade Federal de Viçosa, 2012-02-24) Côco, Daniela; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://lattes.cnpq.br/9172176806887950O gênero Begomovirus (família Geminiviridae) inclui vírus com genoma composto por uma ou duas moléculas de DNA fita simples, transmitidos a espécies de plantas dicotiledôneas pela mosca-branca Bemisia tabaci. No Brasil, os begomovírus são um dos principais entraves para a produtividade do feijoeiro e tomateiro. Entretanto, begomovírus infectando soja (Glycine max) tem sido apenas esporadicamente relatados. Neste trabalho, foi isolado uma espécie do gênero Begomovirus infectando soja na região de Jaiba-MG e designado Soybean chlorotic spot virus (SoCSV). Para a caracterização da espécie, foi feita a clonagem de seu genoma completo seguida de análise molecular, e da obtenção de clones infecciosos para a determinação de sua gama de hospedeiros. Extratos de DNA total de plantas infectadas foram utilizados para a amplificação do genoma viral completo utilizando-se a DNA polimerase do fago ф29. Os produtos da amplificação foram clonados em plasmídeos, completamente sequenciados e submetidas a análise filogenética. O DNA-A de SoCSV apresentou maior identidade de sequência com o vírus Macroptilium yellow spot virus (85% de identidade), enquanto o DNA-B apresentou maior identidade com o Bean golden mosaic virus (67% de identidade). Este nível de conservação de sequências de SoCSV é suficientemente dissimilar (menos que 89%) para ser considerado uma nova espécie de begomovírus. Nos testes de gama de hospedeiros, dentre as espécies testadas foi constatada a infecção viral nas espécies Nicotiana clevelandii, N. tabacum e N. glutinosa, entretanto nenhum sintoma macroscópico foi observado. As plantas das espécies Capsicum annuum, N. benthamiana, N. debneyi, N. rustica e Glycine max, apresentaram sintomas leves. Os sintomas mais severos foram observados nas espécies Phaseolus vulgaris ‘Pérola’ e ‘Ouro Negro’, consistindo em deformação foliar, bolhosidade, clorose entre as nervuras, mosaico e mosaico dourado. Com o objetivo de induzir o silenciamento de genes em plantas de soja, foi construído um vetor de silenciamento viral baseado no DNA-A do SoCSV, denominado pUFV1713, através da substituição da maior parte da sequência que codifica a proteína capsidial (CP) por um sítio múltiplo de clonagem. Assim como os outros begomovírus, o SoCSV demonstrou não necessitar da proteína capsidial para causar infecção sistêmica. A construção do vetor viral foi confirmada por PCR, clivagem enzimática e sequenciamento. A capacidade de pUFV1713 induzir o silenciamento gênico foi testada com a inserção de um fragmento do gene magnesium chelatase subunit I (ChlI) no seu sítio múltiplo de clonagem, seguido por inoculação em plantas de soja. A infecção viral foi confirmada via PCR aos 21 dias pós-inoculação (dpi). O decaimento dos transcritos do gene endógeno ChlI foi avaliado por PCR em tempo real. Os dados do qRT-PCR confirmam a diminuição dos níveis de expressão do mRNA do gene ChlI nas plantas infectadas mas não nas plantas controles. Coletivamente, estes resultados indicam que o vetor VIGS derivado de SoCSV tem o potencial para aplicações em análises de genômica funcional de soja.Item Análise da família das proteínas PAM2-like em soja: divergência funcional da subfamília das ERD15-like(Universidade Federal de Viçosa, 2014-02-28) Silva, Lucas Araújo Castro e; Pereira, Welison Andrade; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4742902Y6; Bevitori, Rosângela; http://lattes.cnpq.br/3979573959730493; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781848H2; http://lattes.cnpq.br/6413364405549031; Deguchi, Michihito; http://lattes.cnpq.br/9506400333022564O motivo PAM2 está largamente distribuído em proteínas eucarióticas e foi incialmente identificado como um sítio de ligação a proteínas que se ligam à cauda poli (A) (PABP), que participam do metabolismo de RNA. Apesar da relevância do motivo PAM2, uma análise compreensiva de sua ocorrência em proteínas do reino vegetal ainda não foi conduzida. Nesta investigação, a família das proteínas PAM2-like foi caracterizada filogeneticamente em Arabidopsis, soja e arroz. Um total de 19 sequências PAM2-like foi identificado no genoma de Arabidopsis, enquanto que em soja foram encontrados 31 membros e em arroz 22 membros da família. A família PAM2-like foi subdividida em 7 subfamílias (A-G) baseado na conservação de sequências e na estrutura de motivos característicos. Entre elas, a subfamília ERD15-like, cujo nome foi derivado da proteína ERD15 (Early Responsive to Dehydration 15) de Arabidopsis, identificada originalmente por sua rápida indução em resposta à desidratação, foi caracterizada extensivamente, em relação à sua filogenia, responsividade à seca e função celular. Foi observado em dados de micro arranjo de plantas estressadas que os dois membros da subfamília ERD15-like de Arabidopsis, AtERD15 (AT2G41430) e AtERL15 (AT4G14270), são responsivos à seca. O perfil de resposta ao estresse causado pela seca de 4 dos 6 membros da subfamília de soja também foi avaliado, sendo que o par Glyma14g05980 e Glyma02g42860 progressão do estresse, ao é continuamente induzido com a passo que o par Glyma11g20940 e Glyma04g28560 é inicialmente induzido, mas tem seu nível de expressão reduzido no estresse mais severo, indicando uma possível divergência funcional na subfamília ERD15-like. A superexpressão e supressão do gene AtERD15 foram avaliadas quanto à sensibilidade à ABA e tolerância à seca. Foi observada uma correlação entre o nível de expressão de AtERD15 (AT2G41430) e a capacidade de germinação de sementes na presença do fito hormônio ABA. Contrariamente, uma correlação negativa foi observada entre o nível de transcrito de AtERD15 e o crescimento de raiz em plantas estressadas por PEG, assim como a tolerância a estresse causado pela seca. Os homólogos da soja, GmERD15-like (Glyma02g42860), e de arroz, OsERD15- like (Os07g46670) complementaram parcialmente o fenótipo de suscetibilidade à ABA durante a germinação apresentado por AtERD15, mas ao contrário de AtERD15, promoveram um aumento da tolerância à seca em plantas estressadas. Coletivamente, estes resultados implicam que os membros da família ERD15 divergem funcionalmente. As proteínas AtERD15, GmERD15- like e OsERD15-like são localizadas no citoplasma em condições normais. Entretanto, em resposta a estresse osmótico o perfil de localização das proteínas é modificado, sendo concentradas ao redor do núcleo. A proteína OsERD15-like (Os07g46670) foi translocada para o núcleo em condições de estresse osmótico. Em expressão transiente em folhas de tabaco, todas três proteínas exibiram o mesmo padrão de localização, estando presentes tanto no citoplasma, como no núcleo, com exclusão do nucléolo. Por fim, foi demonstrado que a proteína GmERD15-like (Glyma02g42860) tem a capacidade de ligação aos promotores dos genes CDC2 (Glyma06g17460) e F- Box (Glyma13g43730) e que sua superexpressão de GmERD15-like em protoplastos de soja levou a indução da expressão de ambos, além do gene DNAJ (Glyma14g31810). Tanto CDC2, como DNAJ e F-Box são induzidos por seca. Estes resultados indicam que GmERD15-like controla um conjunto seleto de genes induzidos por estresse hídrico.Item Identificação de fatores de transcrição que controlam a expressão do gene GmASR3 de soja(Universidade Federal de Viçosa, 2012-07-23) Dadalto, Silvana Pinheiro; Ramos, Juliana Rocha Lopes Soares; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4790613J3; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781848H2; Fietto, Luciano Gomes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4763824H8; http://lattes.cnpq.br/0685179668761044; Loureiro, Marcelo Ehlers; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4780851Y3Proteínas ASR (ABA, Stress and ripening induced protein) são induzidas em situações de estresses, maturação ou na presença de ABA, em diversas espécies vegetais, como Lírio (Lilium longiflorum); cana de açúcar (Saccharum officinarum); uva (Vitis vinífera); arroz (Oriza sativa); petúnia, banana (Musa acuminata e Musa balbisiana) e milho (Zea mays), entre outros. No entanto nenhum gene ASR foi encontrado em Arabidopsis. ASRs são proteínas pequenas, hidrofílicas e sem estrutura definida. Sua função é desconhecida, assim como a via de sinalização a qual pertencem. Em soja foi relatada a presença de três ASRs, que foram denominadas GmASR1, GmASR2 e GmASR3. Este trabalho buscou identificar proteínas que interagem com a região promotora de GmASR3, assim como fatores que se ligam à proteína GmASR3. Após analise em bancos de dados, a região promotora em torno de 500pb a montante do códon de iniciação da transcrição foi obtida a partir de PCR realizado com o DNA genômico de soja (Glycine max, cultivar CD206) e clonado em plasmídeo pHIS2.1. Esta construção foi transformada em leveduras S. cerevisiae W303 para posterior triagem líquida de cDNAs que expressam fatores capazes de interagir com o promotor de GmASR3, a partir do método do mono-híbrido de leveduras. Foi verificado que a proteína GmASR3 possui fraca capacidade de transativação nas condições utilizadas, o que possibilitou a realização de experimentos de duplo-híbrido com o fim de identificar fatores que se ligam à proteína GmASR3. Os fatores que se ligam a GmASR3 foram obtidos através do método do duplo-híbrido de leveduras, utilizando para isso leveduras S. cerevisiae AH109 portadoras do plasmídeo pDest32 ao qual foi inserido a sequencia do cDNA de GmASR3. As triagens de mono e duplo-híbrido foram realizadas utilizando o método da triagem líquida em placas deep well. As colônias que foram consideradas portadoras dos fatores que interagem com o promotor ou com a proteína GmASR foram retransformados em E. coli Dh5α e enviados para sequenciamento.Item Identificação de GmERD 15, um novo fator de transcrição que controla a expressão do gene GmNRP-B em soja(Universidade Federal de Viçosa, 2010-02-12) Alves, Murilo Siqueira; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781848H2; Carvalho, Claudine Márcia; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4794965T6; Fietto, Luciano Gomes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4763824H8; http://lattes.cnpq.br/8216921216597311; Loureiro, Marcelo Ehlers; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4780851Y3; Zerbini Júnior, Francisco Murilo; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783743U5Recentemente foi demonstrado através de experimentos de microarranjos de DNA que as vias de resposta aos estresses no retículo endoplasmático e osmótico convergem aumentando a expressão de um conjunto de genes coordenadamente regulados, dentre eles o gene GmNRP-B codifica uma proteína rica em asparagina e que está envolvida com eventos de morte celular programada em plantas. Este trabalho teve como objetivo principal a identificação e caracterização de fatores de transcrição que controlam a expressão de GmNRP-B, e que portanto constitui um importante componente da via integrativa dos estresses do retículo e osmótico. Para tanto a região promotora de GmNRP-B foi identificada em banco de dados e a partir dela foram construídas fusões de transcrição com os genes repórteres HIS3 e LacZ. Estas construções foram integradas no genoma de leveduras W303, resultando nos transformantes W303-pNRP-His/LacZ, que foram utilizadas como hospedeiras para transformação com uma biblioteca de cDNA de soja construída no vetor pEXP-AD502. Após a varredura da biblioteca, foram selecionados 9 clones, destes 9 apenas um manteve-se positivo após um novo evento de transformação. O sequenciamento do DNA do clone positivo e a comparação de sua seqüência com o banco de dados do Phytozome identificou um gene que codifica uma proteína similar a ERD15 de Arabidopsis. O gene de soja identificado foi denominado GmERD15 e a seqüência de aminoácidos deduzida mostrou que a proteína possui um domínio conservado de interação com proteínas que se ligam à cauda poli A de mRNAs (PABP). A busca por seqüências similares no banco dedados do Phytozome mostrou que o gene encontra-se duplicado no genoma da soja e que além dos dois genes outros 4 constituem esta família gênica em soja. A comparação da seqüência de aminoácidos deduzida com ortólogos ERD15 de diversos organismos mostrou que GmERD15 possui o domínio de interação com PABP conservado em sua porção amino-terminal e uma porção carboxi terminal divergente. A análise do agrupamento destas proteínas mostrou que podemos dividir esta família de proteínas em pelo menos 3 subfamílias sendo que GmERD15 encontra-se em uma subfamília separada da proteína de Arabidopsis. Para confirmar a interação da proteína GmERD15 com a região promotora de GmNRP-B foram realizadas deleções a partir do nucleotídeo -1000 do início de tradução originando fragmentos com 700 e 350 pares de bases. A análise destes promotores por monohíbrido em leveduras mostrou que esta proteína ativa fortemente a expressão de LacZ sob controle do promotor de GmNRP-B de 1000 e 700 pares de bases, porém esta ativação decai consideravelmente quando o promotor é deletado até aproximadamente 350 pares de bases, indicando uma grande perda de cis-elementos. Foi constatado também que GmERD 15 possui atividade de transativação em leveduras. Além disto a análise da sequência de aminoácidos mostrou a presença de um domínio de ativação transcricional na porção carboxi-terminal, e a expressão transiente de GmERD 15 em protoplastos de soja levou a um aumento da expressão de GmNRP-B. Quimeras de GmERD 15 com a proteína YFP expressas transientemente em folhas de tabaco localizam-se no citosol e no núcleo. Coletivamente, estes resultados indicam que GmERD 15 atua no controle da expressão do gene GmNRP-B revelando uma nova família de transfatores, que atuam nocontrole da expressão de genes em plantas.Item Correlação entre a expressão dos genes da subunidade α da β-conglicinina e GmFAD2-1A durante o desenvolvimento da semente de soja(Universidade Federal de Viçosa, 2010-02-25) Cunha, Pricila da Silva; Fietto, Luciano Gomes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4763824H8; Barros, Everaldo Gonçalves de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781285J6; Moreira, Maurílio Alves; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4796105P2; http://lattes.cnpq.br/2712020388620043; Fietto, Juliana Lopes Rangel; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4790238D0; Oliveira, Márcia Rodrigues Carvalho; http://lattes.cnpq.br/0568726713111558O aumento no conteúdo de ácido oléico e diminuição nos níveis dos ácidos graxos polinsaturados (linolênico e linoléico) na semente de soja pode ser alcançado pela redução da atividade da enzima ω-6 dessaturase microssomal através do silenciamento do gene GmFAD2-1A que codifica para essa enzima, resultando na produção de óleos com elevada estabilidade oxidativa. O silenciamento deve ocorrer especificamente na semente de forma a não alterar as características agronômicas da planta e não interferir negativamente no seu crescimento e desenvolvimento. Para isso, o transgene deve estar sob controle de um promotor semente-específico como o promotor do gene da subunidade α da β-conglicinina (promotor pBC). O principal objetivo desse trabalho foi correlacionar o padrão de expressão do gene que codifica a subunidade α da β-conglicinina (gene BC) com o padrão de expressão do gene GmFAD2-1A ao longo do desenvolvimento da semente de soja em cinco variedades que diferem quanto ao teor protéico ("normal" e "alto") e ao ciclo de vida (precoce e tardio). E, através dessa correlação, analisar se opromotor pBC apresenta potencial para ser usado em futuros experimentos de transformação genética de soja que tenha como objetivo silenciar o gene GmFAD2-1A. A análise do padrão de expressão dos genes BC e GmFAD2-1A foi feita por PCR em Tempo Real (qRT-PCR) utilizando dois controles endógenos (GAPDH e EF1b). A subunidade α da β-conglicinina foi quantificada por SDSPAGE/ densitometria durante o desenvolvimento da semente em todos os cinco cultivares. De modo geral, a concentração da subunidade α daβ-conglicinina foi inferior em estádios iniciais de desenvolvimento da semente, aumentando em estádios do meio para o final da maturação, indicando que ocorreu um acúmulo desse polipeptídeo ao longo do enchimento do grão, e apresentando uma concentração alta e significativa na semente madura. As variedades de teor protéico "normal" apresentaram concentrações superiores da subunidade α quando comparadas com suas respectivas isolinhas de maiores teores protéicos, o que ocorreu em estádios do meio para o final da maturação. Os dois genes endógenos (GAPDH e EF1b) normalizaram os dados de expressão dos genes BC e GmFAD2-1A de modo muito similar, com as principais diferenças ocorrendo nos perfis de expressão dos dois genes alvos em estádios do meio e final da maturação nas variedades de ciclo precoce. Entretanto, GAPDH foi melhor normalizador do que EF1b, mostrando expressão mais estável entre todos os tratamentos. De modo geral, o gene BC apresentou maior padrão de expressão em estádios do início e meio da maturação da semente, sendo que nesses estádios pode-se sugerir que o promotor pBC atingiu sua capacidade máxima para ativar a transcrição do gene alvo, com a expressão do gene BC diminuindo em direção aos estádios finais de desenvolvimento da semente. Pode-se sugerir que essa diminuição na expressão do gene BC esteja associada à uma diminuição na atividade do promotor pBC, embora ele ainda permanecesse suficientemente ativo para garantir um nível alto de expressão do transgene em futuros experimentos transformação genética de soja. Nenhuma diferença significativa foi encontrada no padrão de expressão do gene BC quando se comparou uma variedade de soja e sua respectiva isolinha de maior teor protéico ao longo do desenvolvimento da semente. De modo geral, enquanto a concentração da subunidade α foi inferior em estádios iniciais da maturação (1° e 2°), o gene BC apresentou maior padrão de expressão em estádios do início e meio do desenvolvimento da semente (2° e 3°). A partir do 3° estádio em direção ao final da maturação, houve um aumento na concentração da subunidade α enquanto verificou-se uma diminuição na expressão do gene BC em vários desses estádios. A principal diferença foi encontrada na semente madura de todas as variedades que apresentou uma alta concentração do polipeptídeo, apesar de uma expressão quase nula do gene BC. De forma geral, não foi encontrado um padrão de expressão do gene BC e de concentração da subunidade α que permitisse diferenciar o grupo de variedades de ciclo tardio do grupo de ciclo precoce. Em relação ao gene GmFAD2-1A, de modo geral, as variedades de ciclo tardio apresentaram maior padrão de expressão gênica em estádios do meio para o final do desenvolvimento da semente, enquanto nos cultivares de ciclo precoce o gene GmFAD2-1A mostrou maior padrão de expressão em estádios do início e meio da maturação. Assim como para o gene BC a expressão de GmFAD2-1A foi quase nula na semente madura para todas as variedades. De modo geral, a correlação entre o padrão de expressão dos genes BC e GmFAD2-1A nas variedades de ciclo tardio mostrou que nos estádios em que houve maior taxa de transcrição do gene GmFAD2-1A a expressão do gene BC diminuiu após atingir um pico de expressão no 3° estádio. Entretanto, a expressão do gene BC foi ainda superior à do gene GmFAD2-1A nesses estádios. Dessa forma, para os cultivares de ciclo tardio, nos estádios em que o gene GmFAD2-1A apresentou os maiores valores de expressão pode-se sugerir que o promotor pBC está ativo ou com uma capacidade máxima para ativar a transcrição do gene alvo. Nos cultivares de ciclo precoce essa correlação mostrou que os genes BC e GmFAD2-1A apresentaram um padrão de expressão semelhante, com valores elevados de expressão gênica em estádios do início e meio da maturação (2° e 3°), diminuindo em estádios posteriores de desenvolvimento da semente. Portanto, pode-se sugerir que a maior atividade do promotor pBC ocorreu nos mesmos estádios em que foram encontrados os maiores valores de expressão do gene GmFAD2-1A. Dessa forma, pode-se sugerir que o promotor do gene da subunidade α daβ-conglicinina apresenta elevado potencial para ser usado em futuros experimentos de transformação genética que tenha como objetivo silenciar o gene GmFAD2-1A ao longo do desenvolvimento da semente de soja em todos os cultivares analisados.Item Efeito do estresse hídrico na expressão de proteínas em duas variedades de soja contrastantes para o conteúdo de óleo e proteína(Universidade Federal de Viçosa, 2013-11-12) Soares, Carla Quinhones Godoy; Moreira, Maurílio Alves; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4796105P2; http://lattes.cnpq.br/9819216110443917; Ribeiro, Cleberson; http://lattes.cnpq.br/5023387764069051; Fietto, Luciano Gomes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4763824H8; Ramos, Humberto Josué de Oliveira; http://lattes.cnpq.br/4037452920080174; Araujo, Wagner Luiz; http://lattes.cnpq.br/8790852022120851; Teixeira, Arlindo Inês; http://lattes.cnpq.br/2334788531499774Elucidar os processos bioquímicos e fisiológicos que ocorrem em resposta ao estresse hídrico durante o período de desenvolvimento reprodutivo em plantas é importante para prever os impactos das alterações climáticas sobre a qualidade das sementes. Neste trabalho, as variedades de soja Suprema e UFVTN105AP, de sementes com alto teor de óleo e baixo teor de proteína, e baixo teor de óleo e alto teor de proteína, respectivamente, foram submetidas ao déficit hídrico no estádio R5. Neste ponto, foram analisados parâmetros fisiológicos, coletadas folhas e raízes para análise proteômica, seguida de seqüenciamento em espectrômetro de massa (MALDI-TOF- TOF), e identificação pelo Mascot 4®. Foram realizadas análises de PCR quantitativo em tempo real, sendo a quantificação relativa da expressão gênica feita pelo método 2 - ∆ct, utilizando o termociclador SDS ABI PRISM 7500. As plantas foram re-irrigadas, após este ponto, e foram coletadas sementes em R8 para análise do conteúdo de óleo e proteína por espectrofotometria do infravermelho próximo (FT-NIR). Foi verificado, em sementes de plantas submetidas ao déficit hídrico, uma redução no conteúdo de óleo em ambas as variedades, e um aumento no conteúdo de proteína na variedade Suprema. As duas variedades apresentaram uma redução na expressão de enzimas envolvidas no metabolismo de carbono, como a fosfoglicerato cinase, gliceraldeido 3 fosfato desidrogenase, ferrodixina NADPH redutase, ATP sintase e quinona oxidoredutase, que estão relacionadas com a redução do conteúdo de óleo nas sementes. O aumento na expressão de enzimas relacionadas com o metabolismo do nitrogênio, como Glutamina sintetase, proteína 14-3-3, Vspβ, isoflavona redutase e chalcona isomerase, foram observadas na variedade Suprema, tanto em folhas quanto em raízes, e foram relacionadas com o aumento no conteúdo de proteína na semente. A variedade Suprema, em condições de estresse hídrico, mostrou uma elevada expressão da enzima Glutamina sintetase em folhas, o que não foi observado na UFVTN105AP. Este fato pode estar relacionado com o diferente comportamento das duas variedades em relação ao acúmulo de proteína na semente. Os resultados mostram que alterações na composição de óleo e proteína da semente estão relacionadas com a intensidade e duração do estresse hídrico, e ainda, dependentes da variedade em estudo.Item Caracterização bioquímica e funcional de fatores de transcrição envolvidos na resposta a estresses biótico e abiótico em soja(Universidade Federal de Viçosa, 2013-09-02) Alves, Murilo Siqueira; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781848H2; Carvalho, Claudine Márcia; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4794965T6; Fietto, Luciano Gomes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4763824H8; http://lattes.cnpq.br/8216921216597311; Castro, Ieso de Miranda; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4787281A9; Cunha, Luis Claudio Vieira da; http://lattes.cnpq.br/9367947173322278; Bressan, Gustavo Costa; http://lattes.cnpq.br/1153853218347720As respostas a estresses ambientais em plantas culminam em uma drástica reprogramação da expressão gênica favorecendo respostas moleculares a estresses em detrimento das funções celulares normais. Fatores de transcrição são reguladores fundamentais da expressão gênica a nível transcricional, e o controle de suas atividade altera o transcriptoma da planta, determinando mudanças metabólicas e fenotípicas em resposta ao estresse. Análises funcionais de fatores de transcrição são, portanto, muito importantes para a elucidação do papel destes reguladores transcricionais em diferentes cascatas de sinalização. Neste estudo, nós descrevemos a caracterização funcional de fatores de transcrição nas respostas moleculares durante estresses ambientais, tais como estresses no retículo e estresse osmótico, e durante ataque de patógenos. No primeiro capítulo, nós descrevemos um novo fator de transcrição, GmERD15 (Glycine max Early Responsive to Dehydration 15), o qual é induzido por estresse no retículo e osmótico para ativar a expressão de genes NRP (Asparagine-rich protein). No segundo capítulo, descrevemos a identificação de quatro fatores bZIP de soja, GmbZIP62, GmbZIP105, GmbZIPE1 e GmbZIPE2, responsivos à infecção por Phakopsora pachyrhizi, agente causador da ferrugem asiática. O conhecimento das funções destes fatores de transcrição em cascatas de sinalização de respostas a estresses é crucial para a manipulação da tolerância a estresses em cultivares de importância agronômica, e consequentemente determinará o desenvolvimento de variedades de cultivares geneticamente manipulada com melhorada tolerância a estresses.Item Identificação de marcadores SNP em genes candidatos associados ao conteúdo e qualidade do óleo de soja(Universidade Federal de Viçosa, 2012-11-05) Bueno, Rafael Delmond; Barros, Everaldo Gonçalves de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781285J6; God, Pedro Ivo Vieira Good; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4769361T9; Moreira, Maurílio Alves; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4796105P2; http://lattes.cnpq.br/5163173387452113; Piovesan, Newton Deniz; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4728400U5; Teixeira, Arlindo Inês; http://lattes.cnpq.br/2334788531499774O desenvolvimento de cultivares produtivas com incremento significativo no teor de proteína e/ou de óleo, bem como melhorar a composição de ácidos graxos na fração óleo, está entre os principais objetivos dos programas de melhoramento genético de soja. A identificação e validação de marcadores SNP (Single Nucleotide Polymorphism) em regiões gênicas associadas a essas características e o seu emprego na seleção assistida por marcadores moleculares (SAM), representa uma poderosa ferramenta para o melhoramento genético da soja, no sentido de aumentar a eficiência e proporcionar maiores ganhos genéticos. O objetivo deste trabalho foi identificar SNP em regiões gênicas associadas ao conteúdo e a qualidade do óleo em genótipos contrastantes do banco de germoplasma do Programa de Melhoramento da Qualidade da Soja da UFV e validar os polimorfismos como marcadores moleculares em populações segregantes e RILs. Foram selecionados 22 genes candidatos que estão potencialmente relacionados com o conteúdo e a qualidade do óleo em soja. As sequências parciais dos 22 genes candidatos ou de genes homólogos, foram obtidas a partir do GenBank. As sequências gênicas completas foram obtidas por meio do algoritmo BLASTn no banco de dados PHYTOZOME. Os primers desenhados para amplificar regiões específicas de cada gene candidato em genótipos contrastantes para conteúdo e qualidade do óleo de soja, produziram 33,91 kpb de sequencias com boa qualidade, com valor de Phred superior ou igual a 30, sendo identificados 88 SNP e 26 INDELs. Com o intuito de obter informações sobre a expressão dos transcritos dos genes candidatos foi feito um alinhamento por meio do algoritmo BLASTn, contra bibliotecas de ESTs derivadas de sete tecidos de soja, depositados no banco de dados do NCBI. Os resultados mostraram que todos os transcritos selecionados dos genes ADPRI e G3PDH foram expressos constitutivamente, enquanto que os transcritos dos genes ABI3, ACC, AMIP, ARAF, ASIL, CLPPR, CPT, DGAT, DOF4, FUS3, LEC1A, LEC1B, LPCAT, MDH e WRI, apresentaram expressão órgão-específica. Primers de genotipagem TSPCR (Temperature-Swicht Polymerase Chain Reaction) foram utilizados para discriminar os alelos de SNP em cinco populações (RIL e F2). Os polimorfismos identificados por meio do sequenciamento foram inicialmente testados nos respectivos progenitores, sendo para isso, desenhados 20 conjuntos de primers TSPCR. Somente os primers TSPCR desenhados no polimorfismo dos genes AMIP-5, AMIP-3, ABI3, LEC1B, ARAF, LPCAT, PDAT, FAD3B e FAD3C mostraram-se polimórficos, sem bandas inespecíficas e/ou marcação de bandas fracas, nos respectivos progenitores. Os primers de genotipagem TSPCR desenhados no polimorfismo dos genes AMIP-5, AMIP-3, ABI3 e LEC1B foram amplificados em 176 progênies F6 do cruzamento PI371611 x CD222 (contrastantes para teor de óleo). Os primers TSPCR desenhados no polimorfismo dos genes ARAF, LPCAT, e LEC1B foram genotipados em 236 progênies, na geração F6, derivadas do cruzamento CD01RR8311 x SUPREMA (contrastantes para teor de óleo). Os primers TSPCR, desenhados para detectar o polimorfismo presente nos genes ABI3 e LEC1B foram amplificados em 170 progênies F6, derivadas do cruzamento entre A7002 x CD219 (contrastantes para teor de óleo). Os primers TSPCR desenhados para discriminar os alelos de SNP identificados nos genes candidatos ARAF e PDAT, foram amplificados em 259 progênies F6 do cruzamento FA22 x CD219 (contrastantes para teor de ácido oleico). Os primers TSPCR desenhados no polimorfismo dos genes FAD3B, FAD3C e ABI3 foram amplificados em 185 progênies na geração F2 do cruzamento A29 x Tucunaré (contrastantes para teor de ácido linolênico). O polimorfismo do gene ABI3, apresentou associações significativas com teor de proteína na população F6 (A7002 x CD219) e com a característica teor de ácido palmítico, na população F2:3 do cruzamento entre A29 e Tucunaré. Nessa mesma população foram detectadas associações significativas do marcador SNP presente no gene FAD3B com os teores dos ácidos graxos esteárico, oléico e linolênico e do marcador SNP do gene FAD3C com os teores de ácidos linoléico e linolênico. A metodologia de genotipagem TSPCR mostrou ser eficaz na discriminação dos alelos de SNP nas cinco populações estudadas. Associação dos marcadores SNP presentes nos genes ABI3, FAD3B e FA3C, que estão relacionados com a biossíntese dos ácidos graxos, possibilitará o emprego da SAM, com intuito de selecionar indivíduos que apresentem melhor perfil de ácidos graxos, otimizando o desenvolvimento de linhagens de soja especiais para a agroindústria.