Genética e Melhoramento
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Item Begomovirus-host protein-protein interaction network: identifying an intracytoplasmic route for viral DNA intracelular transport(Universidade Federal de Viçosa, 2019-02-27) Mageste, Bianca Castro Gouveia; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://lattes.cnpq.br/7957229598694967Viruses are obligate intracellular parasites and, once in the host cell cytoplasm, they must move intracellularly to and from the replication site to the plasma membrane for spreading. Understanding how viruses hijack the host intracellular transport system using a limited repertoire of proteins provides an opportunity to uncover the molecular bases of the host transport machinery. Begomovirus, a plant ssDNAvirus, use two movement proteins, MP and NSP, to move intracellularly from the site of replication in the nucleus to the cell surface. However, the host components of vDNA complex competent for intracytoplasmic translocation have not been identified, and the underlying mechanism for intracytoplasmic trafficking of vDNA remains to be elucidated. Here, we used a previously fabricated, in situ synthesized protein microarray containing 4600 ORFs of Arabidopsis to identify NSP- and MPArabidopsis protein-protein interactions (PPIs). Consistent with the movement function of the viral proteins, the identified NSP-MP-PPI network uncovered direct and indirect interactions, over represented under the terms transport activity ontology, protein binding, membrane-bound organelles, intracellular vesicle, and SNARE complex, which may define an intracellular route for vDNA trafficking. These studies thus provided critical framework for future investigationsto elucidate the molecular mechanisms for intracytoplasmic transport of begomoviruses. Based on this assumption, we selected an NSP-specifically interacting syntaxin-6 domaincontaining protein, designated NISP for further characterization. We provided several lines of evidence indicating that NISP may be involved in directing the intracytoplasmic anterograde movement of NSP-vDNA. First, we used coimmunoprecipitation assays and bimolecular fluorescence complementation assay to confirm that NISP interacted with NSP in planta and showed that the complex formation occurred in trafficking vesicles likely associated to trans-Golgi network (TGN)/early endosome. Second, we showed that NISP exhibited a pro-viral function and the begomovirus infection required the NIPS-NSP interaction. The mutant nisp-1 was resistant to begomovirus as the knock lines displayed attenuated symptoms, a delayed course of infection and accumulated much lower viral DNA as compared to Col-0 and overexpressing lines. This nisp-1 resistance phenotype was reversed by NISP complementation, confirming that the nisp-1 phenotype was due to inactivation of NISP gene. In contrast, the overexpressing lines were hypersensitive to begomovirus, as they displayed an accelerated course of infection and lowered load of viral DNA as compared to Col-0. We took advantage of a highly conserved NISP paralog, AT2G18860, to show that NISP-NSP interaction underscored the molecular bases for the NISP pro-viral function. AT2G18860, which shares with NISP a 78.6% identical syntaxin-6 domain, did not interact with NSP and thusdid not interfere with begomovirus infection. Consistent with these data, NISP, but not AT2G18860, was induced by begomovirus infection. Third, NISP was also demonstrated to interact with NIG, which facilitates the release of the NSP-DNA complex from the nuclear pores to the cytosol, and the presence of NSP enhanced the NISP-NIG complex formation. We used ChIP assay to demonstrate that NISP was also associated with vDNA in infected cells, which may be assembled into a NISP-NIG-NSP multiprotein complex. Finally, the NISP interactions relocated the dispersed cytosolic NIG and viral NSP to trafficking vesicle likely associated to TGN/microsomes; thereby, favoring the interaction of NSP-DNA with MP, which has been shown to bind to microsome-associated SYTA for the MP-mediated cell-to-cell movement of vDNA.Item Development of a new machine learning-derived method for high-throughput prediction of plant receptor-like proteins(Universidade Federal de Viçosa, 2020-02-28) Silva, José Cleydson Ferreira da; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://lattes.cnpq.br/3083063529099935Machine learning (ML) is a field of artificial intelligence that has rapidly emerged in plant molecular biology, thus allowing the exploitation of massive data. The main challenges are to analyze massive datasets and extract new knowledge of cellular systems. Here, we just presented a systematic review to disentangle ML approaches is relevant for plant scientists (Chapter 1). We presented the main steps for ML development, including data selection, features extraction, training algorithms and evaluation of classification/prediction models, indicating role ML algorithm in the post-genomic era. Additionally, based on the systematic review we also developed a framework machine learning method for cell surface receptors prediction (Chapter 2). Two classes of cell surface receptors designated receptor-like protein kinase (RLK) and receptor-like protein (RLPs) are essential for perceiving and processing external and internal signals in plants and animal. Both are involved in plant development and pathogen responses and share a similar extracellular domain, capable of initial sensing environmental signal. However, RLPs have short divergent C-terminal regions not associated with conserved kinase domain characteristic of RLKs. The absence of C-terminal phylogenetic relationships between RLK and RLPs precludes the use of sequence comparison algorithms for high-throughput predictions of the RLP family. Thus, we developed the first RLP predictor in plants designated RLPredictiOme. The RLPredictiOme was implemented based on machine learning models associated with Bayesian inference. The ML models were developed in three stages to distinguish RLPs from noRLPs, RLPs from RLKs and classify new subfamilies of RLPs in plants. The evaluation of the models resulted in a high accuracy, precision, sensitivity, and specificity and relatively high probability ranging from 0.79 to 0.99 for RLPs predictions. In addition, a complete validate the of RLPredictiOme was performed with LRR-RLPs of previously characterized Arabidopsis RLPs, Arabidopsis and rice and more than 90% of known RLPs were correctly predicted. In addition to predicting previously characterized RLPs, RLPredictiOme uncovered new RLP subfamilies in the Arabidopsis genome. These include a probable lipid transfer (PLT)-RLP, plastocyanin-like-RLP, ring finger-RLP, glycosyl-hydrolase-RLP, and glycerophosphoryl diester phosphodiesterase (GDPDL)-RLP subfamilies, yet to be characterized. In comparison with the only Arabidopsis GDPDL-RLK, molecular evolution studies confirmed that the ectodomain of GDPDL-RLPs from Arabidopsis might have undergone purifying selection with a predominance of synonymous substitutions. Expression analyses revealed that predicted GDPGL-RLPs display a basal level of expression and respond to developmental and biotic signals. The results of these biological assays substantiate the notion that the members of this subfamily have maintained functional domains during evolution and may play relevant roles in development and plant defense. Therefore, RLPredictiOme can provide new insights into the functional role of surface receptors and their relationships with different biological processes. Keywords: Machine learning. Receptor-like protein. RLPredictiOme.Item Ensaios de interação proteína-proteína revelam funções similares de proteínas em diferentes espécies de plantas e patógenos(Universidade Federal de Viçosa, 2023-06-20) Euclydes, Nívea Costa; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://lattes.cnpq.br/1014454844872741Raramente, as proteínas funcionam como formas monoméricas e, frequentemente, exercem suas funções como dímeros ou por meio de interações com outras proteínas (heterodímeros ou oligômeros). Estas interações proteína-proteína são particularmente relevantes em vias de sinalização celulares em que os sinais percebidos por receptores são propagados intracelularmente por meio de interações proteína-proteína. A via de sinalização de morte celular mediada por proteínas DCD/NRPs (“Development and Cell Death Domain-containing N-Rich Proteins”) tem sido caracterizada em soja e representa um importante circuito de sinalização que liga senescência foliar natural com aquela induzida por estresses e pode conferir às plantas tolerância à seca. Exceto por GmNAC30 cujo ortólogo de Arabidopsis ainda não foi identificado, os demais componentes da via em soja, NRP-A, NRP-B, GmNAC81, VPE possuem ortólogo caracterizados em Arabidopsis, AtNRP1, AtNRP2, ANAC36 e gamaVPE, respectivamente. GmNAC30 pertence à família SNACA, compartilhando maior grau de conservação de sequência com ATAF2 de Arabidopsis. Sendo assim, o presente estudo propôs investigar, como primeiro objetivo, a possível participação de AtATAF2 na via de morte celular programada mediada por NRPs, como o ortólogo de GmNAC30. Por meio de ensaios de duplo híbrido em leveduras e BiFC em folhas de Nicotiana benthamiana, foi demonstrado que ATAF2 interage com ANAC36 de uma forma específica e, como GmNAC30, também interage com GmNAC81. Estes resultados sugerem que ATAF2 é provavelmente o parceiro natural de ANAC36 na indução da expressão de VPE. Além disso, ATAF2 é localizado no núcleo e exibe atividade transcricional em leveduras, propriedades bioquímicas próprias de GmNAC30. Dentre os patógenos de plantas economicamente importantes, os geminivírus destacam-se por sua ampla ocorrência no mundo e pela variedade de hospedeiros. Begomovírus constitui o maior gênero da família Geminiviridae, cujas espécies são transmitidas pela mosca branca e representam uma restrição severa à agricultura globalmente. Similarmente a outros vírus, os begomovírus formam rede de interações proteína-proteína entre proteínas virais e do hospedeiro. Recentemente, foi identificado o interactoma entre proteínas virais e do hospedeiro, o qual revelou um “hub” de interação proteína-proteína enriquecidos por proteínas que respondem à auxina. Embora estes resultados sugiram que a sinalização por auxina possa ser funcionalmente relevante durante a infecção por begomovírus, é necessário que estas interações sejam comprovadas por métodos alternativos de interação proteína-proteína. Sendo assim foi selecionado um representado do hub AT4G14560 que interage com ambas as proteínas virais NSP e MP a fim de se confirmar estas interações por ensaio de duplo-híbrido em leveduras. Foi demonstrado que AT4G14560 fusionada ao domínio de ativação (AD) de GAL-4 interage com NSP fusionada ao domínio de ligação (BD) de GAL-4, promovendo autotrofia a His quando coexpressas em leveduras. Assim também BD-AT4G14560 interage com AD-MP em leveduras. As interações foram específicas já que as combinações das proteínas fusionadas com vetores vazios não promoveram autotrofia à histidina em leveduras cotransformadas. Estes resultados validam os resultados de arranjo de proteínas e confirmam o possível envolvido de auxina na infecção viral, o que deverá ser investigado posteriormente. Um hub funcional bem definido do sistema imune de plantas corresponde a interconexões convergentes para a proteína CSN5A, para a qual convergem proteínas de patógenos divergentes, como C2 de geminivírus. Este hub também é enriquecido de proteínas de defesa de plantas. Considerando que a proteína AtWWP1 possui atividade antiviral contra geminivírus, foi de interesse verificar a proteína AtWWP1 também faz parte do hub imune derivado de CSN5A. Inicialmente, por meio do sistema duplo-híbrido de leveduras, foi examinada a possível interação das proteínas CSN5A e AtWWP1. A interação entre as respectivas proteínas em leveduras foi confirmada pela ativação do gene repórter LacZ, quantificado pela atividade da enzima β-galactosidase, e autotrofia à histidina em leveduras transformadas com as combinações CSN5A-BD e AtWWP1-AD, mas não em leveduras transformadas pelas combinações com vetores vazios. Além disso, a interação entre as proteínas CSN5A e AtWWP1 foi monitorada in vivo por meio dos ensaios de co- imunoprecipitação e BiFC. Nos experimentos de Co-IP, o anticorpo anti-GFP imunoprecipitou separadamente a proteína CSN5A-GFP e GFP, sendo que a proteína AtWWP1-HA foi detectada somente no imunocomplexo de CSN5A-GFP, confirmando associação estável e específica entre as proteínas AtWWP1 e CSN5A nos extratos protéicos de folhas de N. benthamiana transformadas com as respectivas construções. Nos ensaios de BiFC, coexpressão de AtWWP1 fusionada ao C-terminal de YFP e CSN5A fusionada ao N-terminal de YFP e vice-versa, promoveu a reconstituição de fluorescência no núcleo de células de folhas de N. benthamiana, mas não os controles negativos. Coletivamente, esses resultados demonstram que CSN5A e AtWWP1 interagem in vivo no núcleo de células vegetais. Estes resultados também reforçam o argumento de que o hub imune CSN5A é funcional durante a infecção por geminivírus. Palavras-chave: interação proteína proteína; patógenos de plantas; hub imune CSN5A.Item Functional modulators of the pro-begomoviral protein NIG (NSP-Interacting GTPase)(Universidade Federal de Viçosa, 2021-11-18) Raimundo, Gabriel Angelo Saraiva; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://lattes.cnpq.br/5975168814090492The Begomovirus (Geminiviridae family) genome codes for multifunctional proteins responsible for viral replication, viral transport, subverting, and co-opting host functions to favor viral infections. The movement protein NSP (Nuclear Shuttle Protein) binds and escorts vDNA from the nucleus to the cytosol. The Arabidopsis thaliana cytosolic protein NIG (NSP-Interacting GTPase) accessorizes NSP transport from the nucleus to the cytosol. Accordingly, the overexpression of NIG confers enhanced susceptibility to begomovirus, thus placing NIG as a potential pro-begomoviral protein. Among host proteins, NIG associates with the endosomal NISP (NSP-interacting syntaxin domain- containing protein) to help NSP-vDNA traffic through the cytoplasm; and WWP1 (WW domain-containing protein 1), which entraps NIG in nuclear bodies. CSN5A (COP9 Signalosome Subunit 5a) is a potential NIG partner that has been shown to redirect it to the nucleus; however, NIG-CSN5A dynamic has not been elucidated. Since NIG partners influence its nuclear import, we examined whether some physiological stimulus could affect NIG localization. A phytohormone screening by confocal microscopy showed that salicylic acid (SA) could redirect NIG to the nucleus. Nuclear fractionation assays also indicated that SA could alter NIG localization to the nucleus. A WWP1 Knockout line overexpressing NIG displayed the same confocal and nuclear fractionation pattern, indicating that SA-mediated transport was independent of WWP1-mediated nuclear import of NIG. Additionally, SA promoted NIG ubiquitination and degradation, a process prevented by the proteasome inhibitor MG132. To elucidate the underlying mechanism for the proteasome-mediated degradation of NIG, the interaction between NIG and CSN5A was further investigated. CSN5A negatively regulated NIG turnover and interacted with NIG in vivo by co-immunoprecipitation assays. In the absence of stimuli, the NIG-CSN5A complex was predominantly formed in the cytosol, as shown by the BiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation) system, yet several lines of evidence were provided indicating that SA-mediated degradation of NIG may occur in the nucleus. First, SA mediated the nuclear relocalization and degradation of NIG. Second, treatment with MG132 increased the SA-induced nuclear pool of NIG but did not alter the cytosolic levels of the protein. Finally, NIG formed a complex with CSN5A that participates in the proteolytic activity of the COP9 signalosome in the nucleus. To approach NIG role via reverse genetics, an NIG knockout line and independent complemented lines were obtained. Col-0, NIG knockout line, and NIG complemented lines were infected with the begomovirus CabLCV (Cabbage Leaf Curl Virus) through biolistics, but these genotypes did not display differences in resistance parameters against the begomovirus. These results complement the current knowledge on NIG functional modulators in the context of begomovirus infections, which may further elucidate the dynamic regarding this GTPase pro-begomoviral function. Keywords: Begomovirus. NIG. NSP.Item Participação da via de sinalização mediada pela proteína DCD/NRP na morte celular em soja induzida por cádmio e infecção pelo fungo Phakopsora pachyrhizi(Universidade Federal de Viçosa, 2021-05-21) Quadros, Iana Pedro da Silva; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://lattes.cnpq.br/0759131385703220Mudanças ambientais e condições extremas, como variações de temperatura, seca e salinidade, além de estresses bióticos, afetam adversamente o crescimento das plantas e causam grande perda de produtividade para as culturas agrícolas em todo o mundo. Entretanto, as plantas desenvolveram várias estratégias para tolerar esses fatores como mecanismos sofisticados de percepção de estresses, sinalização e respostas de defesa. A via de sinalização de morte celular mediada por DCD/NRPs (Development and Cell Death Domain-containing N-Rich Proteins) tem sido caracterizada em resposta a estresses abióticos, durante senescência foliar natural e em interações incompatíveis. Estes processos biológicos resultam em morte celular programada. O objetivo dessa pesquisa foi verificar a atuação da via de sinalização mediada por DCD/NRPs em resposta ao cádmio (Cd 2+ ), que promove morte celular, e estresse biótico causado pelo fungo Phakopsora pachyrhizi. No capítulo I, foi demonstrado que Cd 2+ limita o crescimento da planta, causa intensa vermelhidão na nervura da folha, amarelecimento da folha e clorose na soja (Glycine max). Esses sintomas foram associados à morte celular programada (PCD) induzida por Cd 2+ , dado que folhas de soja estressadas por Cd 2+ exibiram número reduzido de núcleos, morte celular, dano ao DNA e atividade da caspase-1 aumentados em comparação com folhas não estressadas. Consistente com estas observações, Cd 2+ causou indução dos genes NRPs, GmNAC81, GmNAC30 e VPE, que são os componentes da sinalização de morte celular mediados por DCD/NRP, que executam PCD via atividade de caspase-1 de VPE (Vacuolar Processing Enzyme). Além disso, a superexpressão do regulador positivo desta sinalização de morte celular, GmNAC81, aumentou a sensibilidade ao estresse de Cd 2+ e intensificou as marcas de PCD mediada por Cd 2+ . A superexpressão de GmNAC81 aumentou a produção de H 2 O 2 induzida por Cd 2+ , morte celular, dano ao DNA e expressão de VPE. Por outro lado, a superexpressão de BiP, um regulador negativo do módulo de sinalização NRPs/GmNACs/VPE, conferiu tolerância ao estresse de Cd 2+ e redução da morte celular mediada por Cd 2+ . O segundo capítulo focalizou na interação entre o fungo biotrófico Phakopsora pachyrhizi e soja. Esforços de triagem em germoplasmas de sojas levaram à identificação de várias fontes de resistência a P. pachyrhizi mediada por genes Rpp. Entretanto, a caracterização dos efetores ou outros determinantes que contribuem para o reconhecimento dos isolados de P. pachyrhizi em soja não foi completamente elucidada. Neste estudo, também foi investigado se a via DCD/NRP poderia estar envolvida em interações compatíveis e incompatíveis durante a infecção com P. pachyrhizi em plantas de soja suscetíveis, BR16 e Conquista, e resistentes, BRS511 e TMG7262. Após 72 h da inoculação, a expressão dos componentes da via foi induzida nas linhagens suscetíveis BR16 e conquista e na linhagem resistente TGM7262 embora em extensões diferentes. Significantemente, a expressão dos componentes da via de morte celular em condições normais foi muito superior na linhagem resistente TGM7262, resultando em altíssima expressão de VPE, um componente importante de HR. Estes resultados sugerem que a via DCD/NRP de morte celular é ativada durante a infecção com o fungo. A fim de avaliar o envolvimento de VPE nos mecanismos de resistência, a expressão de VPE foi constitutivamente aumentada na linhagem suscetível BR16 através de superexpressão do gene GmNAC081. A superexpressão constitutiva de GmNAC081 alterou o fenótipo de suscetibilidade, sendo que as plantas transgênicas infectadas apresentaram menor número de urédias abertas e amarelecimento menos intenso das folhas ao longo da infecção, quando comparadas com BR16 não transformada. Estes resultados sugerem que a expressão aumentada de VPE pode retardar o processo de infecção pelo fungo P. pachyrhizi em soja. Entretanto, a superexpressão de um regulador negativo da via DCD/NRP, BiP, não inibiu a indução dos componentes da via DCD/NRP durante a infecção. A expressão de VPE em plantas superexpressando GmBiPD foi induzida em todos os tempos analisados após a inoculação e as plantas apresentam maior severidade de infecção, com maior número de urédias abertas e um amarelecimento acentuado do tecido. Sendo a via de sinalização de morte celular mediada por DCD/NRP induzida pelos hormônios ácido abscísico (ABA) e ácido salicílico (AS), foi também investigado o acúmulo desses hormônios em plantas infectadas. Observou-se que plantas superexpressando BiP acumularam um nível superior dos hormônios ABA e AS do que as plantas controle conquista. Provavelmente, o acúmulo acentuado de ABA e AS nas linhagens transgênicas superaram o efeito negativo de BiP na indução da via DCD/NRP. Coletivamente, estes resultados sugerem que a via de morte celular mediada por DCD/NRPs integra uma resposta coordenada a diversos sinais de estresses, portanto, sua manipulação possui o potencial para melhorar a tolerância da cultura a estresses bióticos e abióticos. Palavras-chave: Sinalização celular. Proteínas ricas em asparagina. Cd. Fungo. Morte celular. Morte celular mediada por NRP. Soja. Proteína de ligação. BiP. Enzima de processamento vacuolar. VPE.Item Regulação de genes responsivos a estresses abióticos: tolerância a alumínio em sorgo e distúrbio fisiológico em eucalipto(Universidade Federal de Viçosa, 2020-02-20) Martins, Laura Gonçalves Costa; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://lattes.cnpq.br/7369606408386792