Interação entre β-caseína e naringina: um estudo cinético e termodinâmico

Abstract

A naringina (NR) é um flavonóide com importantes propriedades bioativas, mas sua baixa solubilidade em água, baixa biodisponibilidade e seu gosto amargo limitam sua aplicação em diferentes formulações. Uma estratégia para superar essas limitações é o transporte da NR através da interação com β-caseína (βCN), que é uma proteína com alto potencial para carrear compostos bioativos hidrofóbicos. Assim, o presente trabalho teve como objetivo estudar as interações entre βCN e NR utilizando espectroscopia de fluorescência (EF) e ressonância plasmônica de superfície (RPS), em diferentes temperaturas e pH 7,0. A constante de interação (K b ) foi da ordem de 10 4 L·mol -1 e o complexo βCN/NR apresentou estequiometria 1:1. A variação da energia livre de Gibbs padrão (ΔG°) foi negativa, indicando que o equilíbrio químico favoreceu a formação do complexo βCN/NR. De 20 a 34,15 °C, os valores da variação da entalpia padrão (ΔH°) e da variação da entropia padrão (ΔS°) foram positivos, indicando que o processo de formação do complexo βCN/NR foi regido pelo aumento da entropia. Já acima de 34,15 até 36 °C a complexação foi regida pela entalpia e entropia (ΔH° < 0 e TΔS° > 0). O valor negativo da variação da capacidade calorífica padrão (ΔCp° = -7,047 kJ·K -1 ·mol -1 ) indicou que interações mais fracas ocorrem no sistema quando o complexo é formado. Os valores de K b determinados por RPS foram menores que os obtidos por EF, ou seja, da ordem de 10 3 L·mol -1 , indicando que a interação da NR próxima ao Trp-143 ocorre com uma maior constante de interação do que aquelas que ocorrem longe da região do Trp da βCN. Essas diferenças são explicadas pelos princípios de cada técnica. Por exemplo, na EF a proteína se encontra em solução e na RPS a proteína é imobilizada em um chip sensor. Assim como em EF, na análise de RPS os valores de ΔG° foram negativos, sendo o processo de complexação entropicamente dirigido na faixa de temperatura de 20 a 28 °C, evidenciado pelos valores positivos de ΔH° e ΔS°. Na interação βCN/NR, os valores da constante de associação (k a ) e da constante de dissociação (k d ) aumentaram linearmente com o aumento da temperatura, indicando que tanto a formação como a dissociação dos complexos βCN/NR ocorrem em uma única etapa. A formação do complexo ativado a partir da associação das moléculas de βCN e NR livres requeriu uma energia de ativação mais alta (E act(a) = 15,7 kJ mol - ) do que a formação do complexo ativado a partir da dissociação do complexo termodinamicamente estável (E act(d) = 8,22 kJ·mol -1 ), sendo E act(a) e E act(d) positivos e independentes da temperatura. O demais parâmetros enérgéticos obtidos a partir da associação de βCN e NR livres ou dissociação do complexo βCN/NR termodinamicamente estável foram depentendes da temperatura, sendo positivos os valores de ΔG ‡ (a), ΔG ‡ (d), ΔH ‡ (a) e ΔH ‡ (d) e negativos os valores de TΔS ‡ (a) e TΔS ‡ (d) . Este estudo forneceu parâmetros termodinâmicos e cinéticos de formação do complexo βCN/NR que podem contribuir para otimizar a aplicação da NR como um ingrediente bioativo nas indústrias de alimentos e farmacêuticas. Palavras-chave: Naringina. β-caseína. Interação.

Naringin (NR) is a flavonoid with important bioactive properties, but its low water solubility, low bioavailability and bitter taste limit its application in different formulations. A strategy to overcome these limitations is the transport of NR through interaction with β-casein (βCN), which is a protein with high potential to carry hydrophobic bioactive compounds. Thus, the goal of this work was to study the binding between βCN and NR using fluorescence spectroscopy (FS) and surface plasmon resonance (SPR), at different temperatures and pH 7.0. The binding constant (K b ) was of the order of 10 4 L·mol -1 and the βCN/NR complex presented 1:1 stoichiometry. The standard Gibbs free energy change (ΔG°) was negative, indicating that chemical equilibrium favored the βCN-NR complex formation. From 20 to 34.15 °C, the standard enthalpy change (ΔH°) and standard entropy change (ΔS°) values were positive, which indicated that the complex formation process was driven by increased entropy. Already above 34.15 to 36 °C the complexation was driven by enthalpy and entropy (ΔH° < 0 and TΔS° > 0). The negative value of the standard heat capacity change (ΔCp° = -7.047 kJ·K -1 ·mol - ) indicated that weaker interactions occur in the system when the complex is formed. The K b values determined by SPR were lower than those obtained by FS, i.e., on the order of 10 3 L·mol -1 , indicating that the interaction of NR close to Trp-143 occurs with a greater interaction constant than those which occur far from the Trp region of βCN. These differences are explained by the principles of each technique. For example, in EF the protein is in solution and in RPS the protein is immobilized on a sensor chip. As in EF, in the RPS analysis the ΔG° values were negative, being the entropically driven complexation process in the temperature range of 20 to 28 °C, evidenced by the positive ΔH° and ΔS° values. In the βCN/NR binding, the association constant (k a ) and dissociation constant (k d ) values increased linearly with increasing temperature, indicating that both formation and dissociation of the βCN/NR complexes occur in a single step. Activated complex formation from the association of free βCN and NR molecules required higher activation energy (E act(a) = 15.7 kJ·mol -1 ) than activated complex formation from the dissociation of the stable βCN/NR complex (E act(d) = 8.22 kJ·mol -1 ), being E act(a) and E act(d) positive and independent of temperature. The other energetic parameters obtained from the association of free βCN and NR or dissociation of the thermodynamically stable βCN / NR complex were dependent on temperature, being positive the values of ΔG ‡ (a) , ΔG ‡ (d) , ΔH ‡ (a) and ΔH ‡ (d) and negative the values of TΔS ‡ (a) and TΔS ‡ (d) . This study provided thermodynamic and kinetic parameters of βCN/NR complex formation that may contribute to optimize the application of NR as a bioactive ingredient in the food and pharmaceutical industries. Keywords: Naringin. β-casein. Interaction.