Modelagem da adesão e formação de biofilme em monocultura de Escherichia coli, Listeria monocytogenes e Salmonella enterica subsp. enterica e avaliação da interação em cocultura com Enterococcus faecalis

Abstract

A adesão e formação de biofilmes por bactérias patogênicas e deteriorantes são indesejáveis na indústria de alimentos devido aos problemas de contaminação e a difícil remoção no processo de higienização. Desta forma, é importante quantificar e minimizar o risco de adesão e fatores que o afeta, uma ferramenta para 1sso é utilizar a microbiologia preditiva, que permite prever as influências das condições ambientais no comportamento microbiano. Além disso, os biofilmes são formados por várias espécies bacterianas, e possíveis Interações entre as espécies podem ocorrer, por exemplo, as interações sinérgicas podem tornar os membros desta comunidade mais tolerantes e resistentes aos sanitizantes, já nas interações competitivas ou antagônicas pode ocorrer a presença de micro-organismos inibidores de outros individuos nos biofilmes. Nesse contexto, a primeira parte do trabalho aborda o desenvolvimento de modelos matemáticos preditivos de adesão e formação de biofilmes das bactérias Escherichia coli, Listeria monocytogenes, e Salmonella enterica subsp. enterica e E. faecalis, em função dos efeitos do pH e temperatura. Utilizou-se microplacas de poliestireno com 96 poços contendo caldo Brain Heart Infusion em pH ajustado para a adesão e formação de biofilmes, os ensaios foram conduzidos em diferentes combinações de pH (4, 5,6, 7,8,€e 9) e temperatura (5 °C, 15°C, 25 °C, 25 °C e 45 °C). Com os dados experimentais, modelos de probabilidade de regressao logistica foram construidos para cada bacteria, os modelos apresentaram bom ajuste com poder preditivo adequado e, verificou-se que com o aumento da temperatura o risco de o evento acontecer é maior. Na segunda parte do estudo os objetivos foram verificar as interações sinérgicas em cocultura entre as bactérias e avaliar a capacidade antagônica de E. faecalis em competir, excluir ou deslocar os patógenos durante a formação dos biofilmes em diferentes temperaturas e correlacionar essa inibição com as propriedades de autoagregação e coagregação. Finalmente, determinar a cinética de inativação dos micro-organismos patogênicos presentes nos biofilmes em monocultura e em cocultura com E. faecalis sob ação do sanitizantes dicloroisocianurato de sódio e cloreto de benzalcônio e avaliar se houve aumento da resistência para inativação dos biofilmes quando cultivados em cocultura. Poucas ocorrências de efeitos sinérgicos foram encontradas na formação de biofilmes entre os isolados, em 144 combinações houve somente quatro efeitos sinérgicos que foram: S. enterica e L. monocytogenes nas temperaturas de 15 CempH8€e9,a25 CempH8e também E. coli e E. faecalis na temperatura de 35 CepH8. E. faecalis teve pouca capacidade em inibir a formação de biofilmes dos patógenos, promovendo baixas reduções decimais (<1 ciclos log) pelos três mecanismos investigados: competição, exclusão ou deslocamento. A capacidade de coagregação de E. faecalis com os patógenos também foi baixa e, esta baixa porcentagem de coagregação (< 20%) pode indicar porque houve pouca capacidade de inibir ou diminuir a adesão desses patógenos pelos mecanismos de inibição de biofilmes testados. As cinéticas de inativacao dos biofilmes dos patógenos em monocultura ou cocultura com E. faecalis sob ação dos sanitizantes teve um bom ajuste ao modelo bifásico de Cerf, e permitiu informações detalhadas sobre as taxas de inativação correspondentes às subpopulações sensíveis e resistentes e com base nas análises dos parâmetros cinéticos f, kmax, kmax? € valores D, além do tempo de redução de 4 ciclos log ficou claro que não houve aumento da resistência do composto clorado na inativação de todos os patógenos nos biofilmes em cocultura. Nos biofilmes de Salmonella e E. coli em cocultura com E. faecalis também não apresentaram resistência ao cloreto de benzalcônio, entretanto, Listeria em biofilmes de cocultura com E. faecalis, demostrou pelos paramentros cinéticos que ocorreu um aumento da resistência ao cloreto de benzalcônio. As imagens de microscopia eletrônica de varredura obtidas para o biofilme em monocultura e cocultura mostraram que não houve diferença visual na arquitetura dos biofilmes para as espécies estudadas.

Adhesion and formation of biofilms by pathogenic and spoilage bacteria are undesirable in the food industry due to food contamination problems and difficult removal in the sanitation process. Thus, it 1s important to quantify and minimize the risk of adhesion and factors that affect it, a tool for this is to use predictive microbiology, which allows predicting the influence of environmental conditions on microbial behavior. In addition, biofilms are formed by several bacterial species, and possible interactions between Species can occur, for example, synergistic interactions can make members of this community more tolerant and resistant to sanitizers, whereas in competitive or antagonistic interactions the presence may occur of inhibiting microorganisms from other individuals in biofilms. In this context, the first part of the work addresses the development of predictive mathematical models of adhesion and biofilm formation of the bacteria Escherichia coli, Listeria monocytogenes, and Salmonella enterica subsp. enterica and E. faecalis, as a function of the effects of pH and temperature. Polystyrene microplates with 96 wells containing Brain Heart Infusion broth at pH adjusted for adhesion and biofilm formation were used, the assays were conducted in different combinations of pH (4, 5, 6, 7, 8, and 9) and temperature (5 °C, 15 °C, 25 °C, 25 °C and 45 °C). With the experimental data, logistic regression probability models were built for each bacterium, the models showed a good fit with adequate predictive power, and it was found that with increasing temperature the risk of the event happening 1s greater. In the second part of the study, the objectives were to verify the synergistic interactions in coculture between bacteria and to evaluate the antagonistic capacity of EF. faecalis to compete, exclude or displace pathogens during the formation of biofilms at different temperatures and to correlate this inhibition with the properties of self-aggregation and co-agegregation. Finally, to determine the inactivation kinetics of pathogenic microorganisms present in biofilms in monoculture and in coculture with £. faecalis under the action of sanitizers sodium dichloroisocyanurate and benzalkonium chloride and to evaluate if there was an increase in resistance to inactivation of biofilms when cultivated in co-culture. Few occurrences of synergistic effects were found in the formation of biofilms among the isolates, in 144 combinations there were only 4 synergistic effects which were: S. enterica and L. monocytogenes at temperatures from 15 °C at pH 8 and 9, to 25 °C at pH 8 and also E. coli and E. faecalis at a temperature of 35 °C and pH 8. E. faecalis had little capacity to inhibit the formation of pathogen biofilms, promoting low decimal reductions (<1 log cycles) by the three mechanisms investigated: competition, exclusion or displacement. The coaggregation capacity of E. faecalis with pathogens was also low, and this low percentage of coaggregation (< 20%) may indicate why there was little capacity to inhibit or decrease the adhesion of these pathogens by the biofilm inhibition mechanisms tested. The biofilm inactivation kinetics of pathogens in monoculture or coculture with £. faecalis under the action of sanitizers had a good fit to the Cerf biphasic model, and allowed detailed information on the inactivation rates corresponding to sensitive and resistant subpopulations and based on the analysis from the kinetic parameters f) kmax1, Kmax2,, and D values, in addition to the reduction time of 4 log cycles, 1t was clear that there was no increase in the resistance of the chlorinated compound to the inactivation of all pathogens in biofilms in coculture. In biofilms of Salmonella and E. coli co-cultured with £. faecalis also did not show resistance to benzalkonium chloride, however, Listeria in biofilms co-cultured with E. faecalis, demonstrated by the kinetic parameters that there was an increase in resistance to benzalkonium chloride. Scanning electron microscopy images obtained for biofilm in monoculture and coculture showed that there was no visual difference 1n the architecture of the biofilms for the studied species.