In vitro neoformation of organs in Bixa orellana L.: morphoanatomy, cloning and characterization of pluripotency-associated putative transcription factors

Abstract

Pluripotency is the characteristic of plant cells that allows a single cell to originate the tissues that will compose the plant body. Organogenesis is a regeneration pathway with basis of these principles to induce organ neoformation. The plant growth hormones associated with molecular events are essential to the success of these morphogenic pathways. Thus, the objectives of this study were: to evaluate the morphogenic response in vitro from different explants of Bixa orellana submitted to organogenic induction; to characterize the cytological changes that occur during shoot and root formation, as well as to follow the mobilization of reserves, and to isolate and characterize genes expressed during the organogenic events. To assess the shoot formation, hypocotyls, injured hypocotyls, rooted hypocotyls with reversed polarity, and petiolate leaves were inoculated in JADS medium, supplemented with B5 vitamins, sucrose (3% w/v), myo- inositol (0.01% w/v), agar (0.6% w/v) and 4.56 μM zeatin, or 2.07 μM meta-topolin, or 4.14 μM meta-topolin. Samples with 0, 3, 6, 9, 18, 21, 24 and 30 days were collected for light microscopy, scanning electron microscopy, and histochemical tests following specific protocols. In order to assess the root formation, plantlets were inoculated in JADS medium in similar conditions as cited above, but with 0 or 2.46 μM indolilbutyric acid (IBA). After 0, 2, 4, 6, 8, 10, 18 and 20 days, samples were collected to perform the same analyses mentioned before. Total RNA was extracted from the organogenic material, from which the cDNA was obtained and used as a template for the amplification of coding sequences using degenerate primers for BABY BOOM (BBM) and SHOOT MERISTEMLESS (STM). It was observed that in Bixa orellana zeatin and meta-topolin induced shoot formation, but the injured hypocotyls as well as rooted hypocotyls with reversed polarity optimized the process when compared with hypocotyl and petiolate leaves. The first cell divisions were observed in the first weeks of culture in induction medium, especially in explants cultured in medium supplemented with zeatin. After 30 days of cultivation, zeatin and meta-topolin induced the formation of leaf primordia in the evaluated explants. Proteins were evidenced mainly in rooted hypocotyls and petiolate leaves. Starch grains were found in all types of explant evaluated, and a gradual increase in the concentration of this reserve compound was observed during the induction period. The neutral red test did not indicate the presence of lipids during the organogenic process. Plantlets inoculated in JADS with IBA have cell divisions after four days of culture, originating lateral root primordia. The maintenance in the induction medium supplemented with IBA for 20 days led to the formation of lateral roots. In the same period, lateral root primordia were observed in the control. The histochemical tests evidenced the presence of protein, which were consumed during the organogenic event, in addition to starch grains and lipids present in all evaluated days. Consensus sequence obtained from BBM and STM degenerate primers were cloned and sequenced. The consensus sequences obtained were compared to non-redundant protein databases NCBI, Phytozomee TAIR, using the BLAST algorithm. The analysis and alignment of sequences yielded three contigs similar to members of APETALA2-like family, especially BBM, WRINKLED (WRI) and AINTEGUMENTA (ANT), and three contigs with high similarity to transcription factors of Class I KNOX, especially STM. These results demonstrate the morphogenetic responses of different types of explants subjected to induction medium, and the possible members of the AP2-like and Class I KNOX families cloned from the analyzed sequences, which are associated with the acquisition of competence for in vitro organogenesis in Bixa orellana.

A pluripotencialidade é uma característica das células vegetais que permite uma única célula originar a maioria dos tecidos que irão compor o corpo da planta. A organogênese é uma via de regeneração que se baseia nesses princípios para induzir a neoformação de órgãos. Os hormônios de crescimento vegetais associados aos eventos moleculares são essenciais para o sucesso dessa via morfogênica. Diante disto, os objetivos desse trabalho foram: avaliar a responsividade morfogênica in vitro de diferentes explantes de Bixa orellana submetidos a condições de indução organogênica; caracterizar as mudanças citológicas que ocorrem durante a formação de brotos e raízes, acompanhar a mobilização de reservas; e isolar e caracterizar genes expressos durante os eventos organogênicos. Para avaliar a formação de brotos hipocótilos, hipocótilos feridos, hipocótilos enraizados inoculados com a polaridade invertida, e folhas pecioladas foram inoculados em meio JADS suplementado com vitaminas B5, sacarose (3% w/v), mio-inositol (0,01% w/v), ágar (0,6% w/v) e 4,56 μM de zeatina, 2,07 ou 4,14 μM de meta-topolina. Amostras com 0, 3, 6, 9, 18, 21, 24, e 30 dias foram coletadas para microscopia de luz, microscopia eletrônica de varredura, e testes histoquímicos todas seguindo protocolos específicos. Para avaliar a formação de raízes, plântulas foram inoculadas em meio JADS em condições similares citadas acima, mas contendo 0 ou 2,46 μM de ácido indolilbutríco (AIB). Após 0, 2, 4, 6, 8, 10, 18, e 20 amostras foram coletadas e procedimento citados acima foram seguidos. A partir de material organogênico extraiu-se o RNA total e obteve-se o cDNA, o qual serviu como molde para amplificação das sequências codantes utilizando-se primers degenerados para os genes BABY BOOM (BBM) e SHOOT MERISTEMLESS (STM). Observou-se que em B. orellana tanto a zeatina quanto a meta topolina induziram a formação de brotos, porém o ferimento do hipocótilo, bem como a inversão da polaridade em hipocótilos enraizados otimizaram o processo, quando comparados aos hipocótilos e folhas pecioladas. As primeiras divisões celulares foram observadas nas primeiras semanas de cultivo em meio de indução, principalmente em explantes cultivados em 7meio acrescido de zeatina. Após 30 dias de cultivo, zeatina e meta topolina induziram a formação de estruturas caulinares e diferenciação de primórdios foliares nos explantes avaliados. Na histoquímica, reservas proteicas foram evidenciadas principalmente em hipocótilos enraizados e folhas pecioladas. Grãos de amido foram evidenciados em todos tipos de explante avaliados, e um aumento gradual na concentração desse composto de reserva foi observado ao longo do período de indução. O teste de vermelho neutro não indicou a presença de lipídios durante o processo organogênico. Explantes caulinares cultivados em meio JADS com AIB apresentaram divisões celulares após quatro dias de cultivo, que deram origem a primórdios de raízes laterias. A manutenção em meio de indução, suplementado com AIB, por 20 dias levou a formação de raízes laterais. Neste mesmo período primórdios de raízes laterais foram notados no controle. Os testes histoquímicos evidenciaram a presença de proteínas, que foram consumidas ao longo do evento organogênico, além de grãos de amido e lipídios presentes em todos os tempos avaliados. Sequências consenso obtidas a partir de primers dos degenerados de BBM e STM foram clonadas e sequenciadas. As sequências consenso obtidas foram comparadas em bancos de proteínas não redundantes do NCBI, Phytozome e TAIR, usando o algoritmo BLAST. A análise e o alinhamento das sequências geraram três contigs semelhantes a membros da família APETALA2-like, especialmente BBM, WRINKLED (WRI) e AINTEGUMENTA (ANT), e três contigs com alta similaridade aos fatores de transcrição da Class I KNOX, especialmente STM. Estes resultados demonstram as respostas morfogênicas de diferentes tipos de explantes submetidos aos meios de indução, e os possíveis membros das famílias AP2-like e Class I KNOX clonados a partir das sequênicas analisadas, e que estão associadas com a aquisição de competências para formação de órgãos in vitro em Bixa orellana.