Expressão transiente de genes de Phakopsora pachyrhizi em genótipos resistentes de soja visando a identificação de genes de avirulência

Abstract

O Brasil é o segundo maior produtor mundial de soja. Atualmente, o principal fator limitante na produção desta cultura é a ferrugem asiática da soja (FAS), cujo agente etiológico é o fungo Phakopsora pachyrhizi. Os fungos causadores das ferrugens são parasitas obrigatórios que durante sua interação com a planta secretam proteínas efetoras que manipulam o metabolismo do hospedeiro e interferem com suas respostas de defesa. Algumas dessas proteínas efetoras, denominadas proteínas Avr, são reconhecidas pelas proteínas codificadas por genes de resistência R, o que desencadeia a resposta de hipersensibilidade (HR) e fenótipo de resistência. Já foram descritos pelo menos cinco genes R (Rpp1 a Rpp5) que conferem resistência a FAS e vários genes que codificam proteínas secretadas por esse fungo foram recentemente identificados. Todavia, ainda não foram identificadas as proteínas efetoras (Avr) reconhecidas pelas proteínas codificadas pelos genes Rpp. Como não existe ainda um sistema de transformação para P. pachyrhizi, uma estratégia para identificar as proteínas Avr desse fungo é a expressão transiente das proteínas efetoras candidatas no citoplasma de variedades resistentes e a observação do possível desencadeamento de resposta de HR. Desta forma, os objetivos específicos deste trabalho foram tentar estabelecer uma metodologia de expressão transiente em soja via agroinfiltração utilizando como gene repórter o gene GUSPlus; estabelecer um protocolo de translocação de proteínas efetoras via sistema de secreção tipo III (SST3) de Pseudomonas syringae pv. glycinea raça 4 (Psg4), e também avaliar a atividade efetora de genes candidatos em genótipos de soja resistentes ao isolado monopustular PPUFV02 de P. pachyrhizi. Não se observou a expressão do gene GUSPlus em folhas de soja agroinfiltradas com Agrobacterium tumefaciens estirpe EHA105, enquanto que utilizando do mesmo preparo de inóculo e concentração de células bacterianas, observou-se a expressão consistente do gene GUSPlus em tabaco. Este resultado invibializou o uso de agroinfiltração no estudo funcional de genes efetores candidatos na soja. Todos os genótipos de soja avaliados foram suscetíveis a Psg4, demonstrando a vialibilidade do uso desta bactéria na análise funcional de proteínas candidatas a efetores mediada por SST3. Melhor reprodutibilidade de sintomas foi observada com a inoculação por infiltração a vácuo de Psg4 numa concentração bacteriana de OD600=0,01, por permitir uma análise dos sintomas de forma gradual. O produto do gene avrB é reconhecido pela produto do gene RPG1, presente em alguns genótipos de soja. A construção pVSP61-avrB, foi capaz de induzir HR no genótipo Williams 82, que contêm o gene RPG1 correspondente, e nos genótipos Conquista e PI 459025. Este resultado permitiu o uso desta construção como controle positivo para a análise funcional de proteínas efetoras putativas de P. pachyrhizi. Assim, 12 sequências foram clonadas no vetor pEDV6. Este vetor permite a expressão de proteínas de interesse fusionadas a sequências-sinais de secreção via SST3, visando a sua posterior translocação para o citosol. Nove das construções com pEDV6-PHPA_RSP transformadas em Psg4 foram submetidas à análise funcional. As plantas inoculadas variaram quanto à severidade dos sintomas observados e não foi constatado fenótipo de HR. Ao invés disso, nos tratamentos foi observado redução, aumento ou ausência de alteração significativa na evolução dos sintomas, de maneira genótipo-dependente. Esses estudos permitiram uma primeira triagem de candidatos a efetores de P. pachyrhizi, selecionando os candidatos PHPA_RSP_71 e PHPA_RSP_78 como os mais promissores para estudos futuros mais detalhados.

Brazil is the second world soybean producer. Currently, the main limiting factor in this crop production is the Asian soybean rust (ASR) whose etiologic agent is the fungus Phakopsora pachyrhizi. The rust fungi are obligate parasites that during their interaction with the plant, they secrete effector proteins that manipulate host metabolism and interfere with their defense responses. Some of these effector proteins, called Avr proteins, are recognized by encoded proteins by resistant R genes, which usually trigger a hypersensitivity response (HR) and resistance phenotype. At least, there are five described R genes (Rpp1 to Rpp5) that confer resistance to ASR and several genes that encode secreted proteins by this fungus were recently identified. However, the effector proteins (Avr) recognized by encoded proteins by Rpp genes were not identified yet. Since there is not a transformation assay protocol for P. pachyrhizi, a strategy to identify this fungus Avr proteins is the transient expression of R proteins in resistant varieties cytoplasm and the observation of a possible HR response. Thus, the specific objectives of this work were: to try to establish a methodology for transient expression in soybean by agroinfiltration using the gene GUSPlus as reporter gene; to establish a protocol for translocation of effector proteins by the type III secretion system (SST3) of Pseudomonas syringae pv. glycinea race 4 (Psg4), and also to evaluate the effector activity of candidate genes in soybean resistant genotypes to the isolate PPUFV02 of P. pachyrhizi. There was no expression of the gene GUSPlus in Agrobacterium tumefaciens strain EHA105 infiltrated soybean leaves, while using the same inoculum preparation and concentration of bacterial cells, there was a consistent expression of the gene GUSPlus in tobacco. This result derailed the use of agroinfiltration in the functional study of candidate genes in soybean effectors. All soybean genotypes evaluated were susceptible to Psg4, demonstrating that the viability to use this bacterial on functional analysis of candidate effector proteins mediated by SST3. Better symptoms reproducibility was observed with inoculation by vacuum infiltration of Psg4 in a bacterial concentration of OD600 = 0,01, for allowing a gradually symptoms analysis. The encoded protein by avrB gene is recognized by the RPG1 gene product, which is present in some genotypes of soybean. The construction pVSP61-avrB was able to induce HR in the genotype Williams 82, that contains the corresponding gene RPG1 and to induce it in the genotypes Conquista and PI 459025. This result allowed the use of this construction as a positive control for functional analysis of P. pachyrhizi putative effector proteins. Because of this, 12 sequences were cloned into vector pEDV6. This vector allows the expression of proteins of interest fused to secretion signal sequences by SST3, aiming its subsequent translocation into the cytosol. Nine from the constructions with pEDV6-PHPA_RSP transformed into Psg4 were submitted to functional analysis. The inoculated plants varied in severity of observed symptoms and no HR phenotype was observed. Instead, it was observed reduction, increase or absence of a significant change in the symptoms evolution of genotype-dependent manner in treated plants. These studies allowed a first screening of P. pachyrhizi effector candidates, selecting the candidates PHPA_RSP_71 and PHPA_RSP_78 as the most promising candidates for further detailed analysis.