Deciphering cellular and molecular mechanisms during cytokinin-induce pluripotency in annatto (Bixa orellana L.) explants

Abstract

Plants regenerate organs through coordinated developmental reprogramming triggered by wounding and hormonal cues. In Bixa orellana, mechanistic time-course studies are often constrained by inhibitor-rich tissues that compromise RNA purity and downstream RT-qPCR. This dissertation addressed that bottleneck and then applied an integrative, time-resolved framework to compare how two cytokinin inputs—thidiazuron (TDZ) and zeatin—shape de novo shoot organogenesis. First, an RNA extraction and cleanup workflow was optimized for organogenic, metabolite-rich hypocotyl explants sampled across a 0–20-day induction series. Previously published approaches yielded quantifiable RNA but showed a marked late-stage decline in A260/230 ratios and reduced amplification performance, consistent with inhibitor carryover. An adapted CTAB–LiCl strategy coupled to DNAse treatment and phenol: chloroform cleanup maintained high A260/230 values across all treatments and time points. It supported consistent amplification of the reference gene RPL38, enabling reliable time-resolved RT-qPCR. Next, longitudinally sectioned hypocotyl explants from 30-day-old in vitro seedlings were cultured on JADS medium under three conditions: control (no plant growth regulators), 4.56 µM TDZ, or 4.56 µM zeatin. Morphogenic progression and histological staging were assessed across 0–20 days. RT-qPCR profiled meristem/competence, cell-cycle, and auxin-biosynthesis markers across 4–20 days (efficiency-corrected quantification; log fold-change relative to time- matched controls), and antioxidant enzyme activities (SOD, POX, CAT) were quantified at key induction stages. Both cytokinins enhanced organogenesis relative to the control but produced distinct outcomes: TDZ promoted compact meristematic- like domains, while zeatin supported more progressive organization and shoot-bud development by later stages. Transcript dynamics revealed cytokinin- and stage- specific signatures, with early competence-associated induction of WUS and SERK1 under TDZ (significant at days 4 and 8), delayed WUS induction under zeatin (significant at days 12 and 20), and a zeatin-specific transition marked by significant STM repression at day 16. Zeatin strongly upregulated proliferative regulators (CYCD3 was significant at days 8 and 12; APC2 was significant at day 8), while APC1 was significantly induced at day 8 underboth cytokinins. Late induction was characterized by strong YUC10 activation under both treatments (significant at days 16 and 20), with an additional significant increase at day 12 under zeatin, indicating enhanced auxin-biosynthetic potential during advanced stages. Antioxidant profiles indicated distinct redox kinetics: CAT activity was significantly reduced at day 8 under both cytokinins; POX was significantly higher at day 8 under zeatin but significantly reduced at day 12 under both cytokinins; and SOD inhibition declined earlier under zeatin (significant at days 12 and 20) than under TDZ (significant at day 20). Together, the results support a phased model in which TDZ accelerates early competence-associated activation, zeatin reinforces mid-induction proliferation and organized development, and both cytokinins converge on late auxin-related activation coupled to treatment-specific antioxidant dynamics. The methodological and biological outcomes provide a robust platform for mechanistic regeneration studies and for refining cytokinin regimes to optimize organogenic quality in Bixa orellana. Keywords: Bixa orellana; de novo organogenesis; in vitro regeneration; cytokinin; thidiazuron (TDZ); zeatin; RT-qPCR; RNA extraction; antioxidant enzymes; time- course analysis.Plantas regeneram órgãos por meio de reprogramação do desenvolvimento, desencadeada por injúria e modulada por sinais hormonais. Em Bixa orellana, estudos mecanísticos em série temporal podem ser limitados pela alta complexidade química dos tecidos, que dificulta a obtenção de RNA com pureza adequada para RT-qPCR. Esta dissertação enfrentou esse entrave metodológico e, em seguida, aplicou uma abordagem integrativa e temporal para comparar como dois sinais de citocinina—tidiazuron (TDZ) e zeatina—modulam a organogênese caulinar de novo. No Capítulo I, foi otimizado um protocolo de extração e limpeza de RNA para explantes hipocotilares organogênicos, amostrados ao longo de 0–20 dias. Protocolos previamente descritos geraram RNA quantificável, porém com queda acentuada de A260/230 em estágios tardios e pior desempenho em amplificação, compatível com carreamento de inibidores. A adoção de uma estratégia CTAB–LiCl, associada a tratamento com DNAse e purificação adicional com fenol:clorofórmio, manteve valores elevados de A260/230 em todos os tratamentos e tempos e sustentou amplificação consistente do gene de referência RPL38, viabilizando RT- qPCR em série temporal. No Capítulo II, explantes de hipocótilo longitudinalmente seccionados, obtidos de plântulas in vitro com 30 dias, foram cultivados em meio JADS sob três condições: controle (sem reguladores de crescimento), 4,56 µM TDZ ou 4,56 µM zeatina. A progressão morfogênica e o estadiamento histológico foram avaliados ao longo de 0–20 dias. A RT-qPCR acompanhou genes associados à identidade meristemática/competência, ciclo celular e biossíntese de auxina entre 4–20 dias (quantificação corrigida por eficiência; log de mudança relativa ao controle do mesmo tempo), e as atividades de enzimas antioxidantes (SOD, POX e CAT) foram quantificadas em fases-chave da indução. Ambas as citocininas intensificaram a organogênese em relação ao controle, porém com trajetórias distintas: TDZ favoreceu domínios compactos meristemáticos/meristemoides, enquanto a zeatina sustentou uma organização mais progressiva, com formação de estruturas compatíveis com gemas caulinares em estágios tardios. As assinaturas transcricionais mostraram especificidade por tratamento e por fase, com indução precoce significativa de WUS e SERK1 sob TDZ (dias 4 e 8), indução tardia significativa de WUS sob zeatina (dias 12 e 20) e uma transição associada à zeatina marcada por repressão significativa de STM no dia 16. A zeatina reforçou fortemente reguladores proliferativos (CYCD3 significativo nos dias 8 e 12; APC2 significativo no dia 8), enquanto APC1 apresentou indução significativa no dia 8 sob ambas as citocininas. Em fase tardia, observou-se ativação robusta de YUC10 sob TDZ e zeatina (significativa nos dias 16 e 20), com aumento adicional significativo no dia 12 sob zeatina, indicando maior potencial de biossíntese de auxina durante a progressão organogênica. As enzimas antioxidantes revelaram cinéticas distintas: CAT foi significativamente reduzida no dia 8 sob ambas as citocininas; POX aumentou significativamente no dia 8 sob zeatina e foi significativamente reduzida no dia 12 sob ambos os tratamentos; e a inibição de SOD diminuiu mais cedo sob zeatina (significativa nos dias 12 e 20) do que sob TDZ (significativa no dia 20). Em conjunto, os resultados sustentam um modelo em fases no qual TDZ antecipa a ativação inicial associada à competência, a zeatina reforça a fase intermediária de proliferação e organização do desenvolvimento, e ambos os tratamentos convergem para ativação tardia relacionada à auxina, acompanhada por dinâmicas antioxidantes dependentes do tratamento. Os avanços metodológicos e biológicos apresentados fornecem uma base robusta para estudos mecanísticos e para o refinamento de regimes de citocinina visando otimizar a qualidade organogênica em Bixa orellana. Palavras-chave: Bixa orellana; organogênese de novo; regeneração in vitro; citocinina; tidiazuron (TDZ); zeatina; RT-qPCR; extração de RNA; enzimas antioxidantes; análise temporal.