Expressão Heteróloga, Purificação e Avaliação do uso da E-NTPDase (GDPase) de Leishmania major como Antígeno Recombinante no Diagnóstico da Leishmaniose Visceral Canina

Abstract

A leishmaniose visceral canina é uma doença zoonótica emergente altamente prevalente em países tropicais. Vários estudos têm utilizado proteínas recombinantes em testes sorológicos para o seu diagnóstico. Este trabalho descreve a expressão heteróloga em sistema Escherichia coli BL21 (DE3) pET-21b da GDPase de Leishmania major. A proteína recombinante GDPase (rGDPase) foi expressa com uma cauda Hexa-HIS fusionada no C-terminal e purificada sob condições nativas por cromatografia de afinidade em resina Ni2 + -agarose. Após a otimização da expressão e purificação, antissoro policlonal contra rGDPase de L. major foi produzido e purificado para retirada de anticorpos inespecíficos contaminantes anti-E. coli. A proteín recombinante foi utilizada como antígeno em testes sorológicos (ELISA indireto) contra soros de cães saudáveis ou cães infectados por Leishmania spp. com diferentes formas da doença (assintomáticos, oligossintomáticos ou polissintomáticos). Os estudos indicaram que é possível produzir essa proteína recombinante e que o antígeno recombinante pode ser utilizado nos testes soro diagnóstico, mas deve ser otimizado principalmente no que diz respeito à sua pureza.The canine visceral leishmaniasis is an emerging zoonotic disease highly prevalent in tropical countries. Several studies have used recombinant proteins in serological tests for its diagnosis. This work describes the heterologous expression in Escherichia coli BL21-(DE3) pET-21b system of Leishmania major GDPase. The GDPase recombinant protein (rGDPase) was expressed as a fusion with a Hexa-HIS tag at the C-terminal and purified under native conditions by affinity chromatography on Ni2 +-agarose resin. After optimization of expression and purification, polyclonal antiserum against rGDPase of L. major was produced and purified from contaminating E. coli proteins. The recombinant protein was used as antigen in serological tests (indirect ELISA) against sera from healthy dogs or dogs infected by Leishmania spp. with disease various stages (asymptomatic, oligosymptomatic or polysymptomatic). The studies indicated that it s possible to produce this recombinant protein and that the recombinant antigen may be used in serum diagnostic tests but must be optimized mainly with respect to its purity.