Bactérias formadoras de esporos em sobremesas lácteas e queijo petit suisse: ocorrência e modelagem matemática da formação de biofilmes multiespécies

Abstract

As sobremesas lácteas são produtos refrigerados e, amplamente comercializados c consumidos devido às suas características nutricionais, praticidade c apelo sensorial. A sua deterioração está relacionada a alterações na textura, odor e produção de sabores indesejáveis causados por bactérias formadoras de esporos e outras bactérias termodúricas que produzem enzimas termoestáveis causadoras de deterioração. Por outro lado, a capacidade de formação de biofilmes por bactérias formadoras de esporos e termodúricas, nas superfícies dos equipamentos durante as etapas de processamento dos produtos lácteos, pode provocar contaminação cruzada, deterioração dos produtos finais em curto tempo ou antes de atingir sua vida útil. Além disso, as falhas nos procedimentos de limpeza c sanitização dos equipamentos podem favorecer a desenvolvimento de biofilmes. Portanto, evitar sua formação c garantir sua eliminação têm se tornado um desafio constante na indústria de laticínios e de alimentos em geral. Deste modo, esta pesquisa teve como objetivos determinar a ocorrência de bactérias formadoras de esporos em dois tipos de sobremesas lácteas e queijos petit suisse, que foram submetidos a altas temperaturas para induzir a germinação de esporos bacterianos. Também foram avaliadas a capacidade de crescimento de células vegetativas em diferentes condições, bem como a síntese de enzimas proteolíticas e suas taxas de multiplicação. Por fim, foram determinados os tempos nos quais as principais bactérias isoladas foram capazes de formar biofilmes multiespécies em cupons de aço inoxidável, quando incubados a 6, 15, 25 e 32 ºC durante 24, 48, 72, 96 e 120 h. Os resultados indicaram uma maior ocorrência de bactérias mesófilas aeróbias com maior atividade proteolítica e lipolítica, além de uma maior taxa de crescimento. Doze isolados apresentaram alta capacidade de síntese de enzimas e taxa de crescimento. Esses isolados foram identificados geneticamente como B. subtilis, B. cereus, B. thuringiensis, B. tequilensis, Bacillus spp. e B. parabrevis. Por outro lado, em relação à capacidade de formação de biofilmes multiespécies pelas espécies supracitadas, foram consideradas como biofilmes quando as contagens foram maiores que 5,0 log UFC.cm-² e os dados foram transformados para forma binária e utilizados para desenvolvimento de modelos probabilísticos de regressão logística. O programa estatístico Minitab v.12.1, foi utilizado. O desempenho de cada modelo foi avaliado pelo índice estatístico de Nagelkerke R², pela porcentagem (%) de dados corretos e pelo índice estatístico de Hosmer-Lemeshow. Destaca-se que os biofilmes formados na temperatura de incubação de 32 ºC foram mais robustos, seguidos pelos biofilmes formados à temperatura de 25 °C, ao contrário do que foi observado a temperatura de 6 ºC. Também foi evidenciado que o mix bacteriano 2 (formado por B. thuringiensis, B. subtilis, B. cereus e Bacillus spp. isolados de sobremesa láctea Queijo Petit Suisse com Preparado de Frutas) teve maior probabilidade de formação de biofilme em menor tempo. Além disso, foi demonstrado que superfícies de aço inoxidável permitem a adesão bacteriana e, consequentemente, a formação de biofilmes multiespécies. Esses resultados reforçam a necessidade de medidas de controle contra bactérias aeróbias mesófilas formadoras de esporos ou termodúricas, para garantir a qualidade microbiológica durante toda a cadeia de produção, diminuição das perdas de produção, controle da vida útil estabelecida, evitar danos à reputação da marca e perdas de vendas. Os resultados permitiram determinar fatores fundamentais para o desenvolvimento de estratégias de controle de biofilmes multiespécies e o estabelecimento de protocolos de sanitização mais eficientes. Palavras-chave: Derivados lácteos, Bactérias deteriorantes, Atividade enzimática, Biofilmes multiespécies, Microbiologia preditiva.

Their deterioration is related to changes in texture, odor, and the production of undesirable flavors caused by spore-forming bacteria and other thermoduric bacteria that produce heat-stable spoilage enzymes. Additionally, the ability of spore-forming and thermoduric bacteria to form multispecics biofilms on equipment surfaces during milk processing and/or dairy derivatives production can lead to cross-contamination, rapid product deterioration, and spoilage before reaching their expiration date. Moreover, the presence of biofilms can compromise cleaning and sanitization procedures. Therefore, preventing biofilm formation and achieving their elimination have become ongoing challenges in the dairy and food industry. Thus, this rescarch aimed to determine the presence of spore-forming bacteria in two types of dairy desserts and queijos petit suisse, which were subjected to thermal shock to induce bacterial spore germination. The study also evaluated the growth capacity of vegetative cells under different conditions, as well as the synthesis of proteolytic enzymes and their multiplication rates. Finally, the study determined the time intervals in which the main isolated bacteria were capable of forming multispecies biofilms on stainless steel coupons when incubated at 6, 15, 25, and 32 °C for 24, 48, 72, 96, and 120 h. The results indicated a higher occurrence of mesophilic aerobic bacteria with increased proteolytic and lipolytic activity, along with a higher growth rate. Twelve isolates, demonstrating superior enzyme synthesis capacity and growth rate. These isolates were genetically identified as B. subtilis, B. cereus, B. thuringiensis, B. tequilensis, Bacillus spp., B. parabrevis, S. marcescens, E. xiangfangensis, and Enterobacter spp. Regarding the formation capacity of multispecies biofilms by the aforementioned species, bacterial counts were considered as microbial biofilms when exceeding 5.0 log CFU.cm-², and the data were transformed into binary form for the development of logistic regression models. The models were adjusted to the data from the three co-cultures using the statistical software Minitab v.12.1. Subsequently, the performance of each model was evaluated based on the Nagelkerke R² statistic, percentage (“%) of correct data, and the Hosmer-Lemeshow statistic. It is noteworthy that biofilms formed at an incubation temperature of 32 °C were more robust, followed by the temperature of 25 °C, in contrast to the observations at 6 °C. It was also evident that bacterial mix 2 (formed by B. thuringiensis, B. subtilis, B. cereus and Bacillus spp. isolated from dairy dessert Petit Suisse Cheese with Fruit Preparation) had a higher probability of forming biofilms in a shorter time. Additionally, it was demonstrated that stainless steel is a type of surface that favors bacterial adhesion and, consequently, the formation of multispecies biofilms. These results reinforce the need for control measures against mesophilic acrobic spore-forming or thermoduric bacteria to ensure microbiological quality throughout the production chain, reduce production losses, control established shelf life, prevent damage to brand reputation, and minimize sales losses. These challenges continue to be faced by the Brazilian dairy industry. The results allowed for the determination of fundamental factors for the development of strategics to control multispecies biofilms and the establishment of more efficient sanitization protocols in terms of time. Key words: Dairy derivatives, Spoilage bacteria, Thermoduric bacteria, Proteolytic activity, Lipolytic activity, Thermostable enzymes, Bacterial biofilms, Predict microbiology.