Produção e caracterização bioquímica de fitases de Rhizopus stolonifer e Aspergillus niger UFV-1 e suas aplicações em ração animal

Abstract

Neste trabalho, duas cepas fúngicas isoladas da castanha macadâmia e de bagaço de cana-de-açúcar foram avaliadas quanto ao potencial para produção de fitases, visando aplicação em processos biotecnológicos, principalmente em rações animais. O fungo Rhizopus stolonifer, isolado a partir da macadâmia, foi cultivado em meio líquido contendo infusão de batata, sacarose, peptona, Tween-20, e CaCl2, utilizando a metodologia de superfície de resposta (MSR) para otimizar a produção de fitases. O uso da MSR resultou em uma atividade enzimática de 0,65 U/mL, valor nove vezes maior em relação à atividade inicial de fitases. A enzima apresentou pH e temperatura ótimas na faixa de 5,0-5,5 e 65 oC, respectivamente, com t1/2 de 50 minutos a 50 ºC. Os valores de KM app e Vmax app foram 0,692 mM e 0,780 Tmol/min, respectivamente. A enzima mostrou-se eficiente na hidrólise de fitato em ração animal, liberando 5,14 Tmol PO4 3-/mL após 5 horas de tratamento. Esse valor é equivalente à concentração inicial de fósforo. O fungo Aspergillus niger UFV-1, isolado de bagaço de cana-de-açúcar, também foi cultivada em meio líquido contendo infusão de batata, sacarose, peptona, Tween-20 e CaCl2. Após oito dias de incubação, o extrato enzimático produzido foi coletado e analisado para a atividade enzimática de fitases. A enzima foi purificada por ultrafiltração, precipitação ácida e cromatografias de troca iônica e gel filtração. A fitase apresentou massa molecular de 161 kDa, determinada por gel filtração e 81 kDa, determinada por eletroforese SDS-PAGE, sugerindo que a enzima é formada por duas subunidades. Os valores de pH e temperatura ótimos foram de 2,0 e 60 ºC, respectivamente. Os parâmetros cinéticos, KM e Vmax, determinados pela equação de Lineweaver-Burk, foram 30,9 mM e 7,48 Tmol/min, respectivamente. A kcat estimada foi de 1,46 x 105 s-1 e kcat/KM foi igual a 4724919 s-1.M-1. A fitase mostrou elevada termoestabilidade, com t1/2 de 6,2 horas a 80 ºC e foi resistente a pepsina e tripsina. Além disso, foi eficiente na liberação de fósforo, quando avaliada em ração animal comercial, liberando 15,3 Tmol PO4 3-/mL, valor equivalente a quatro vezes a concentração inicial de fósforo. Os resultados obtidos sugerem que as duas cepas fúngicas avaliadas têm grande potencial como produtoras de fitases para aplicação industrial, principalmente a cepa de Aspergillus niger UFV-1, cuja fitase apresentou pH ótimo ácido e elevada resistência a proteases.

In this work, two fungi strains isolated from macadamia nut and sugar cane bagasse were evaluated for potential productions of phytases, focusing on biotechnological applications, mainly in animal feed. The fungi Rhizopus stolonifer isolated from macadamia nut was cultivated in submerged fermentation containing potato infusion, sucrose, peptone, Tween-20 and CaCl2, using response surface methodology (RSM) to optimize the phytase production. The use of MSR resulted in an enzyme activity of 0.65 U/mL, a value 9-times the initial phytase activity. The enzyme showed optimum pH and temperature in the range of 5.0-5.5 and of 65 oC, respectivamente, with t1/2 of 50 minutes at 50 oC. The KM app and Vmax app value were 0.692 mM and 0.780 μmol/min, respectively. The enzyme was efficient in phytate hydrolysis in animal feed, releasing 5.14 μmol PO4 3-/mL after 5 h of treatment. This value is equivalent to the initial phosphorus concentration. The fungi Aspergillus niger UFV-1 isolated from sugar cane bagasse was also cultivated in liquid medium containing potato infusion, sucrose, peptone, Tween-20 and CaCl2. After eight days of fermentation, the crude extract produced was collected and analyzed for enzymatic activity of phytases. The enzyme was purified by ultrafiltration, acid precipitation, and ion exchange and gel filtration chromatography. The phytase showed a molecular mass of 161 kDa determined by gel filtration and 81 kDa by SDS-PAGE electrophoresis, suggesting that the enzyme is composed of two subunits. The optimal values of pH and temperature were 2.0 and 60 oC, respectively. The kinetic parameters, KM and Vmax, determined by the Lineweaver-Burk plot, were 30.9 mM and 7.48 Tmol/min, respectively. The kcat estimated was 1.46 x 105 s-1 and kcat/KM was 4724919 s-1.M-1. The phytase showed high thermostability with t½ of 6.2 h at 80 oC and was resistant to pepsin and trypsin. Additionally, it efficiently in release of phosphorus, when evaluated in commercial animal feed, releasing 15.3 Tmol PO4 3-/mL, equivalent to 4-times the initial phosphorus concentration. The obtained results suggest that the two fungi strains evaluated have great potential as phytase producers for industrial application, mainly the strain Aspergillus niger UFV-1 that showed acidic optimum pH and high protease resistance.