Análise funcional da via de sinalização antiviral mediada por NIK em tomateiro

Abstract

A proteína NSP de begomovírus facilita o transporte do DNA viral do núcleo para o citoplasma e coopera com a proteína de movimento MP para promover o transporte do DNA viral às células adjacentes não infectadas através dos plasmodesmas. A proteína NSP interage com membros da família LRR-RLK ( leucine- rich repeat receptor like kinase ), designados NIK ( NSP-Interacting Kinase ). A ligação de NSP na alça de ativação de NIK inibe a atividade quinase, e conseqüentemente, a proteína viral inibe a atividade de autofosforilação desses receptores e sua atividade de defesa antiviral. Estudos de mutagênese na alça de ativação de NIK demonstraram que o resíduo Treonina 474 é fosforilado in vitro e exerce uma função crucial para atividade de quinase que é requerida para sinalização antiviral. Mutação no resíduo de Thr-474 para aspartato resulta no mutante T474D que exibe ativação constitutiva, atividade de fosforilaçao do substrato aumentada e menor efeito inibidor de NSP. Este trabalho teve como objetivo caracterizar o domínio quinase de NIK na resposta de defesa antiviral em tomateiros. Tomateiros foram transformados com a construção que codifica para NIK super ativa (35S-AtNIK-T474D). Os transformantes primários foram selecionados por PCR e a expressão do transgene em linhagens independentes foi confirmada por RT-PCR normal e em tempo real. A super expressão da NIK1 e NIK- T474D super ativa em tomateiros promoveu um alongamento de entrenós, mas afetou negativamente o desenvolvimento do sistema radicular, demonstrando uma possível comunicação cruzada entre a via de sinalização antiviral mediada por NIK e vias de sinalização de desenvolvimento. Experimentos de infectividade foram conduzidos em linhagens transgênicas superexpressando AtNIK ou AtNIK-T474D, utilizando o vírus ToYSV-[MG-Bi2]. Super expressão de NIK super ativa alterou a taxa de infecção por ToYSV e interferiu no desenvolvimento dos sintomas. Comparado com as plantas não transformadas e a linhagem transgênica 35S-AtNIK1-6 superexpressando NIK normal, a taxa de infecção foi inferior e os sintomas mais atenuados em linhagens transgênicas independentes superexpressando AtNIK-T474D. Estes resultados confirmam in planta o papel essencial da fosforilação do resíduo de Treonina 474 de NIK e indicam a possibilidade de se desenvolverem estratégias de tolerância a geminivirus mais eficientes.

The begomovirus NSP (nuclear shuttle protein) facilitates the transport of viral DNA from the nucleus to the cytoplasm and cooperates with the movement protein MP to promote the translocation of viral DNA to the adjacent, uninfected cells through plasmodesmata. NSP interacts with members of the LRR-RLK ( leucine-rich repeat receptor like kinase ) family, designated NIKs ( NSP-Interacting Kinase ). Binding of NSP to the activation loop of NIK inhibits kinase activity and hence the viral protein suppresses receptor autophosphorylation and defense responses. Mutagenesis assays in the activation loop of NIK have demonstrated that the threonine 474 residue is phosphorylated in vitro and plays a crucial role in the kinase activity that is required for signaling. Replacement of Thr-474 with aspartate produces the T474 mutant, which exhibits constitutive activation, enhanced substrate phosphorylation activity and less inhibitory effect by NSP binding. The goal of this investigation was to analyse the NIK kinase domain in defense responses against begomovirus in tomato. The NIK mutant T474D cDNA was placed under the control of 35S promoter into a binary vector for plant transformation (35S-AtNIK-T474D). Primary transformants were selected by PCR and the expression of the transgene was confirmed by normal and quantitative RT- PCR in independently transformed lines. NIK and NIK-T474D overexpression in tomato plants affected the overall developmental performance of transgenic lines, which display elongated stems and a root system less developed. These phenotypes were consistent with a cross-communication between the NIK-mediated antiviral signaling and developmental signaling pathways. Infectivity assays were carried out in AtNIK- and AtNIK-T474D-overexpressing lines, with the virus ToYSV-[MG-Bi2]. Overexpression of super active AtNIK-T474D altered the infection rate by ToYSV, and interfered in symptom development. As compared to untransformed plants and NIK- overexpressing 35S-AtNIK1-6 transgenic lines, independent transgenic AtNIK-T474D lines displayed lower infection rate and attenuated symptoms. These results confirmed in planta the essential role for phosphorylation of the Thr-474 residue for NIK function and underlined the possibility for the development of more efficient tolerance strategies against geminiviruses.