Unraveling the protective and multifaceted roles of exogenous melatonin in Pfaffia glomerata (Spreng.) Pedersen plants under aluminum stress

Abstract

Aluminum (Al) toxicity is the main factor limiting agricultural production in acidic soils worldwide. Excess Al inhibits the growth and function of roots and consequently damages crop development. In this sense, scientists are trying to develop technologies and products to generate plants that are more resistant to metal stress. Plant growth regulators, such as melatonin (MET), have been considered a promising approach to improving crop tolerance to abiotic stress conditions, including stress caused by heavy metals. Among the species of phytotherapeutic interest is Pfaffia glomerata (Spreng.), a plant native to Brazil and popularly known as Brazilian- ginseng. Its medicinal properties are mainly due to the production of the secondary metabolite 20-hydroxyecdysone (20E), a phytoecdysteroid with proven therapeutic and nutraceutical activities in mammals. Studies by our research group have revealed that the species has adaptive plasticity in the face of various abiotic stresses, raising the hypothesis that this adaptation is mainly due to the modulation of secondary metabolism. In this sense, the imposition of aluminum (Al) stress would shed light on the adaptations of P. glomerata to yet another type of abiotic stress and the role of melatonin (MET), a protective and multifaceted molecule that acts as an important free radical scavenger, relieving stress-induced oxidative damage and mediating various physiological responses, including rooting, photosynthesis and senescence. Therefore, we evaluated the effect of high Al toxicity on morphophysiological and molecular aspects and the effect of melatonin application. To this end, two independent in vitro experiments were carried out. Both experiments used seedlings derived from clonal micropropagation from the in vitro germplasm bank. In experiment I, we analyzed the influence of 4 doses of Al: 0, 200, 400, 600 and 800 µM of Al. After 40 days of cultivation, our data showed that concentrations above 600 negatively affected photosynthesis, biomass accumulation, leaf area, volume and total length of roots, photosynthetic pigments and the rate of net photosynthesis. On the other hand, Al toxicity positively altered the content of carbohydrates, starch, carotenoids and total phenols, malate and fumarate, as well as raising proline levels at all the Al concentrations tested. We also observed an increase in some oxidative stress enzymes, especially in the roots (CAT, POD and SOD), as well as an increase in MDA levels in response to the increase in the concentration of Al ions in solution. Al promoted fluctuations in the relative expression of genes in the 20E metabolite and lignin biosynthesis pathway. In experiment II, the physiological and molecular responses of plants exposed to Al and application of MET were analyzed: (I) control; (II) Al 500 µM; (III) MET 100 µM (IIII) Al+MET. Our data showed that MET alleviates the impacts of Al toxicity by maintaining growth parameters, biomass accumulation, chlorophyll and photosynthetic rate. MET also significantly decreases Al accumulation in roots and maintenance of total amino acid and protein content. MET reduced overall levels of DNA endoreduplication. Proteomic profiling revealed 174 differentially accumulated proteins (DPAs), of which 11 were positively regulated by Al, 23 by MET and 24 by the Al+MET interaction. 24, 22 and 26 proteins were negatively accumulated in Al, MET and Al+MET, respectively. Gene ontology and cluster analysis revealed an increase in the relative abundance of proteins involved in transmembrane transport, energy-intensive metabolic transport, energy production in plants such as photosynthesis, ascorbate metabolism, oxidative phosphorylation, carbon metabolism, pentose phosphate and other metabolic pathways associated with the biosynthesis of amino acids (e.g. phenylalanine and tryptophan) and secondary metabolites. DAPs were predominantly present in vacuoles, the cell wall, chloroplasts, and apoplasts. Our results suggest that modification of molecular structure is one of the main causes of cell damage and that vacuolar sequestration of Al ions is an important mechanism of Al resistance in plants. Overall, our results indicate a possible role for MET in protecting P. glomerata against Al toxicity, paving the way for future studies. Keywords: aluminum ; abiotic stress ; brazilian-ginseng ; 20-hydroxyecdysone ; proline; in vitro culture.

A toxicidade do alumínio (Al) é o principal fator que limita a produção agrícola em solos ácidos em todo o mundo. O excesso de Al inibe o crescimento e a função das raízes e, consequentemente, prejudica o desenvolvimento das culturas. Nesse sentido cientistas estão a tentar desenvolver tecnologias e produtos para gerar plantas que sejam mais resistentes ao stress do metal. Os reguladores de crescimento das plantas, como a melatonina (MET), têm sido considerados uma abordagem promissora para melhorar a tolerância das culturas a condições de stress abiótico, incluindo o stress causado por metais pesados. Entre as espécies de interesse fitoterápico, destaca-se a Pfaffia glomerata (Spreng.), planta nativa do Brasil e popularmente conhecida como ginseng-brasileiro. As suas propriedades medicinais devem-se majoritariamente à produção do metabólito secundário 20- hidroxiecdisona (20E), um fitoecdisteroide com comprovadas atividades terapêutica e nutracêutica em mamíferos. Estudos do nosso grupo de pesquisa têm revelado que a espécie tem uma plasticidade adaptativa frente a diversos estresse abióticos, levantando a hipótese que essa adaptação se deve principalmente pela modulação do metabolismo secundário. Nesse sentido, a imposição ao estresse por alumínio (Al) lançaria luz de quais seriam as adaptações em P. glomerata frente a mais um tipo de estresse abiótico e qual seria o papel da melatonina (MET), uma molécula protetora e multifacetada, que atua como importante eliminador de radicais livres, promovendo o alívio dos danos oxidativos induzidos pelo stress e mediando várias respostas fisiológicas, incluindo enraizamento, fotossíntese, senescência. Portanto, avaliamos o efeito da toxicidade do a Al elevada nos aspectos morfofisiológicos e moleculares, bem como o efeito da aplicação de melatonina. Para tal, foram realizados dois experimentos independentes in vitro. Para ambos os experimentos, foram utilizadas plântulas derivadas da micropropagação clonal a partir do banco de germoplasma in vitro. No experimento I, foram analisados a influência de 4 doses de Al: 0, 200, 400, 600 e 800 µM de Al. Após 40 dias de cultivo, os nossos dados mostraram que concentrações a partir de 600 µM de Al afetou negativamente a fotossíntese, o acúmulo de biomassa, área foliar, volume e comprimento total de raízes, os pigmentos fotossintéticos e a taxa de fotossíntese liquida. Por outro lado, a toxicidade do Al alterou positivamente o conteúdo de carboidratos, amido, carotenóides e fenóis totais, malato e fumarato, além de elevar os níveis de prolina em todas as concentrações de Al testadas. Observamos também aumento de algumas enzimas do estresse oxidativo especialmente em raízes (CAT, POD e SOD), além de aumento nos níveis de MDA em resposta ao aumento da concentração de íons Al em solução. O Al promoveu flutuações na expressão relativa de genes da rota de biossíntese do metabólito 20E e da lignina. No experimento II, foram analisadas as respostas fisiológicas e moleculares de plantas expostas ao Al e aplicação de MET: (I) control; (II) Al 500 µM; (III) MET 100 µM (IIII) Al+MET. Os nossos dados demonstraram que a MET alivia os impactos da toxicidade de Al através da manutenção dos parâmetros de crescimento, acúmulo de biomassa, clorofila e taxa fotossintética. A MET também diminui significativamente o acúmulo de Al em raízes e manutenção do teor de aminoácidos e proteínas totais. O MET reduziu os níveis globais de endoreduplicação do DNA. O perfil proteômico revelou um total de 174 proteínas diferencialmente acumuladas (DPAs), das quais 11 foram reguladas positivamente pelo Al, 23 pelo MET e 24 pela interação Al+MET. 24, 22 e 26 proteínas foram acumuladas negativamente em Al, MET e Al+MET, respetivamente. A ontologia genética e a análise de clusters revelaram um aumento da abundância relativa de proteínas envolvidas no transporte transmembranar, no transporte metabólico intensivo de energia, na produção de energia nas plantas, como a fotossíntese, no metabolismo do ascorbato, na fosforilação oxidativa, no metabolismo do carbono, no fosfato de pentoses e noutras vias metabólicas associadas à biossíntese de aminoácidos (por exemplo, fenilalanina e triptofano) e de metabolitos secundários. Os DAPs estavam predominantemente presentes nos vacúolos, na parede celular, nos cloroplastos e apoplastos. Os nossos resultados sugerem que a modificação da estrutura molecular é uma das principais causas de danos celulares e que o sequestro vacuolar de íons Al é um mecanismo importante de resistência ao Al nas plantas. Em geral, os nossos resultados indicam um possível papel da MET na proteção da P. glomerata contra a toxicidade do Al, abrindo caminho para estudos futuros. Palavras-chave: alumínio ; estresse abiótico; ginseng-brasileiro ; 20-hidroxiecdisona ; prolina ; cultura in vitro.