Characterization, regulation, and phylogenetic analyses of the Penicillium griseoroseum nitrate reductase gene and its use as selection marker for homologous transformation

Abstract

Penicillium griseoroseum has been studied because of its efficient pectinases production. In this work, the Penicillium griseoroseum nitrate reductase gene was characterized, transcriptionally analyzed in different nitrogen sources, and used to create a phylogenetic tree and to develop a homologous transformation system. The regulatory region contained consensus signals involved in nitrogen metabolism and the structural region was possibly interrupted by 6 introns coding for a deduced protein with 864 amino acids. RT-PCR analysis revealed high amounts of niaD transcript in the presence of nitrate. Transcription was repressed by ammonium, urea, and glutamine showing an efficient turnover of the niaD mRNA. Phylogenetics analysis showed distinct groups clearly separated in accordance with the classical taxonomy. A mutant with a 122-bp deletion was used in homologous transformation experiments and showed a transformation frequency of 14 transformants/microg DNA. All analyzed transformants showed that both single- and double-crossover recombination occurred at the niaD locus. The establishment of this homologous transformation system is an essential step for the improvement of pectinase production in Penicillium griseoroseum.

Notre groupe étudie Penicillium griseoroseum à cause de sa production efficace de pectinases. Nos travaux ont porté sur la caractérisation du gène de la nitrate réductase de P. griseoroseum, de même que sur son analyse transcriptionnelle en présence de diverses sources d’azote, et celui-ci a été utilisé afin de concevoir un arbre phylogénétique et un système de transformation homologue. La région régulatrice renfermait des signaux consensus impliqués dans le métabolisme de l’azote et la région structurale est potentiellement interrompue par six introns et coderait une protéine déduite de 864 acides aminés. Une analyse par RT–PCR a révélé de fortes quantités de transcrits de niaD en présence de nitrate. La transcription a été réprimée par l’ammonium, l’urée et la glutamine, ce qui démontre un taux de renouvellement efficace de l’ARNm de niaD. Les analyses de phylogénétique ont permis de distinguer des groupes nettement séparés conformément avec la taxonomie classique. Un mutant contenant une délétion de 122 pb a été employé dans les expériences de transformation homologue avec une fréquence de transformation de 14 transformants/μg d’ADN. Tous les transformants analysés ont démontré que des recombinaisons à enjambement simple et double se sont produites dans le locus niaD. La conception de ce système de transformation homologue représente une étape essentielle dans le programme d’amélioration de la production de pectinases chez P. griseoroseum.