Expressão e purificação da proteína recombinante NTPDase2 de Leishmania infantum e sua aplicação no imunodiagnóstico da leishmaniose canina

Abstract

No Brasil as leishmanioses são doenças de caracter zoonótico, sendo transmitida por flebótomos hematófagos da família Psychodidae. O desenvolvimento das formas clinicas: tegumentares ou visceral, está intimamente ligado à espécie envolvida na infecção e ao estado imunológico do indivíduo infectado. O cão é atualmente o principal reservatório de importância epidemiológica. A eliminação de cães infectados é hoje uma das ações de vigilância epidemiológica, sendo orientada por sorodiagnóstico. Nesse estudo a NTPDase2 de L. infantum foi expressa de forma heteróloga em E. coli, e purificada. A proteína rNTPDase2 purificada foi utilizada em ensaio de ELISA indireto em dois bancos de soros. Um banco montado com amostras do município de Caratinga, uma região endêmica para Leishmaniose Visceral Canina (LVC) e o outro banco com amostras do município de Governador Valadares, uma região endêmica para Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA). Também foram incluídas neste estudo 30 amostras de soro de cães de região não endêmica para LVC infectados experimentalmente com T. cruzi. Para as amostras de Caratinga a rNTPDase2 purificada foi utilizada na concentração de 0,5 μg. A sensibilidade foi 100% (IC 95%: 92,60% a 100,0%), a especificidade 100% (IC 95%: 86,77% a 100,0%) e o índice de concordância foi excelente (k= 1). Para as amostras de Governador Valadares o antígeno foi utilizado em três concentrações: 0,5, 1 e 2 μg. Para essas concentrações a sensibilidade variou de 91,67 a 95,35% e a especificidade foi de 100%, o índice de concordância foi excelente (k> 0,8). Amostras de tecidos de 48 cães do município de Governador Valadares foram também utilizadas para ensaio parasitológico direto. Na técnica de imprint foi utilizado tecido de baço e fígado corados com panótico rápido (sensibilidade= 79,16%). Utilizando linfonodo em cortes de 0,5 μM e corados com Giemsa Lento, H&E, a sensibilidade foi de 100% para ambas as técnicas. Na técnica de imunohistoquímica, utilizando soro hiperimune de coelho anti-rNTPDase2, a sensibilidade foi 89,58%. A rNTPDase2 também foi usada em ensaio imunocromatográfico piloto mostrando o potencial para o uso neste tipo de teste. Neste estudo é demonstrado que a rNTPDase2 pode ser utilizada como um novo e potencial antígeno no diagnóstico da LVC.

In Brazil leishmaniasis are zoonotic diseases character, being transmitted by blood-sucking sand flies of the family Psychodidae. The development of clinical forms: visceral or cutaneous, is closely related to species involved in infection and immune status of the infected individual. The dog is currently the main reservoir of epidemiological importance. The elimination of infected dogs is now one of the epidemiological surveillance activities, being guided by serodiagnosis. In this study, NTPDase2 L. infantum is heterologously expressed in E. coli and purified. rNTPDase2 purified protein was used in ELISA assay of sera of two banks. A bank with samples mounted in the city of Caratinga-MG, an endemic area for Canine Visceral Leishmaniasis (CVL) and the other bank with samples of the city of Governador Valadares-MG, a region endemic for American Cutaneous leishmaniasis (ACL). Also included in this study serum samples from 30 dogs from non-endemic area for CVL experimentally infected with T. cruzi. For samples purified Caratinga the rNTPDase2 was used at a concentration of 0,5 μg. The sensitivity was 100% (95% CI: 92,60% to 100,0%), specificity 100% (95% CI: 86,77% to 100,0%) and the index of agreement was excellent (k = 1). For samples Valadares antigen was used in three concentrations: 0,5, 1 and 2 μg. For these concentrations the sensitivity ranged from 91,67 to 95,35% and specificity was 100%, the level of agreement was excellent (k> 0,8). Tissue samples from 48 dogs in the city of Governador Valadares were also used for direct parasitological test. In the technique was used to imprint the spleen and liver tissue stained with fast Panotic (sensitivity = 79,16%). Using lymph node cuts of 0.5 μM and stained with slow Giemsa, H & E, the sensitivity was 100% for both techniques. In immunohistochemistry, using anti rabbit rNTPDase2 hyperimmune serum, the sensitivity was 89,58%. The rNTPDase2 also been used in immunochromatographic assay pilot demonstrating the potential for use in this type of test. In this study it is shown that rNTPDase2 can be used as a new potential antigen for the diagnosis of CVL.