Chrysoporthe wilt in eucalyptus min-stumps: detection, identification of the pathogen, and efficacy of triazole fungicides for disease management
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Universidade Federal de Viçosa
Abstract
The fungus Chrysoporthe cubensis, in addition to causing canker in trees, has also been reported in eucalyptus mini-stumps to cause wilting that can progress to partial or complete canopy drying of the plants. Considering the limited knowledge about Chrysoporthe wilt in mini-stumps, the objectives of this study were: (1) to confirm the identity of the pathogen through phylogenetic analyses using a larger number of isolates; (2) to determine whether Chrysoporthe sp. occupies an endophytic niche in both asymptomatic rooted cuttings and mini-stumps of eucalyptus; (3) to assess the spread of disease from symptomatic mini-stumps to mini-cuttings and rooted cuttings; (4) to evaluate the sensitivity of the pathogen to triazole fungicides and the efficacy of these molecules in controlling the disease in eucalyptus both preventively and curatively; and (5) to develop a LAMP assay for detecting Chrysoporthe spp. Of the 42 selected isolates obtained from asymptomatic and symptomatic mini-stumps, 41 were identified as C. cubensis, while one isolate, recovered from a symptomatic mini- stump, was identified as Chrysoporthe doradensis. This is the first report of C. doradensis in eucalyptus mini-stump in the world. Disease spread through vegetative propagation in clonal mini-gardens, from mini-stumps to mini-cuttings and to rooted cuttings, was not confirmed. Chrysoporthe sp. could not be recovered from eucalyptus rooted cuttings derived from rooted mini-cuttings collected from symptomatic mini-stumps. The EC50 test showed that C. cubensis isolates are highly sensitive to triazole fungicides at low doses: cyproconazole (0.0770 µg/mL), difenoconazole (0.0065 µg/mL), ipconazole (0.0868 µg/mL), and tebuconazole (0.0376 µg/mL). The fungicides application towards the mini-stumps stem did not result in macroscopic symptoms of phytotoxicity. Curative application of fungicides (72 h after pathogen inoculation) resulted in a 26.94% smaller necrotic lesion in the stem compared to the preventive application (72 h before pathogen inoculation) for all fungicides. The application of the molecules 15 days after pathogen inoculation was ineffective in controlling the disease. However, the fungicides ipconazole and tebuconazole were able to reduce the average number of fruiting bodies on the stem surface by 53.7% and 56.9%, respectively. For the LAMP assay, a primer set (FIP, BIP, B3, and F3) was developed based on the TEF 1a gene. The optimal conditions for amplification were a 2:1 ratio of FIP/BIP to F3/B3 primers, temperatures of 65 and 68°C, and incubation times of 75 and 90 minutes. For positive reaction, the color of the reaction changed from pink to yellow. The primer set was able of detecting C. cubensis and C. doradensis. No amplification of non- target fungi, such as Botrytis sp., Fusarium sp., and Trichoderma sp., was observed, providing evidence of specificity for Chrysoporthe species. This study provides important updates into the detection of Chrysoporthe spp., as well as the etiology and control of Chrysoporthe wilt in eucalyptus mini-stumps, aimed at mitigating the impact of the disease in clonal mini-gardens. Keywords: Chrysoporthe cubensis; Chrysoporthe doradensis; Chemical control; Endophytic niche; Eucalyptus; LAMP
O fungo Chrysoporthe cubensis, além de causar cancro em árvores, também foi relatado em minicepas de eucalipto causando murcha, a qual progride para a seca parcial ou total da copa das plantas. Considerando o limitado conhecimento sobre a murcha de Chrysoporthe em minicepas, os objetivos deste estudo foram: (1) confirmar a identidade do patógeno por meio de análises filogenéticas usando um número maior de isolados; (2) determinar se Chrysoporthe sp. ocupa um nicho endofítico em mudas assintomáticas e minicepas de eucalipto; (3) avaliar a disseminação da doença de minicepas sintomáticas para miniestacas e mudas; (4) avaliar a sensibilidade do patógeno a fungicidas triazóis e a eficácia dessas moléculas no controle da doença em eucalipto, tanto preventiva quanto curativamente; e (5) desenvolver a técnica de LAMP para detectar Chrysoporthe spp. A partir dos 42 isolados selecionados obtidos de minicepas assintomáticas e sintomáticas, 41 foram identificados como C. cubensis, enquanto um isolado, obtido de minicepa sintomática, foi identificado como Chrysoporthe doradensis, o que consistiu no primeiro relato de desta espécie em minicepa de eucalipto no mundo. A disseminação da doença por meio da propagação vegetativa, a partir de minicepas para miniestacas e para mudas, não foi confirmada. Chrysoporthe sp. não pôde ser recuperado de mudas de eucalipto oriundas de miniestacas enraizadas coletadas de minicepas sintomáticas. O teste EC50 mostrou que os isolados de C. cubensis são altamente sensíveis aos fungicidas triazóis em baixas doses: ciproconazol (0,0770 µg/mL), difenoconazol (0,0065 µg/mL), ipconazol (0,0868 µg/mL) e tebuconazol (0,0376 µg/mL). A aplicação de fungicidas no caule das minicepas não resultou em sintomas macroscópicos de fitotoxicidade. A aplicação curativa de fungicidas (72 h após a inoculação do patógeno) resultou em uma lesão necrótica no caule 26,94% menor em comparação com a aplicação preventiva (72 h antes da inoculação do patógeno) para todos os fungicidas testados. A aplicação das moléculas 15 dias após a inoculação do patógeno foi ineficaz no controle da doença. No entanto, os fungicidas ipconazol e tebuconazol foram capazes de reduzir o número médio de corpos de frutificação na superfície do caule em 53,7% e 56,9%, respectivamente. Para o ensaio de LAMP, um conjunto de primers (FIP, BIP, B3 e F3) foi desenvolvido com base no gene TEF 1a. As condições ótimas para amplificação foram uma proporção de 2:1 de primers FIP/BIP para F3/B3, temperaturas de 65 e 68 °C e tempos de incubação de 75 e 90 minutos. Para a reação positiva, a cor da reação mudou de rosa para amarelo. O conjunto de primers foi capaz de detectar C. cubensis e C. doradensis. Nenhuma amplificação de fungos não-alvo, como Botrytis sp., Fusarium sp. e Trichoderma sp., foi observada, fornecendo evidências de especificidade para espécies de Chrysoporthe. Este estudo traz importantes atualizações sobre a detecção de Chrysoporthe spp., etiologia e o controle da murcha de Chrysoporthe em minicepas de eucalipto que contribuem para mitigar o impacto da doença em minijardins clonais. Palavras-chave: Chrysoporthe cubensis; Chrysoporthe doradensis; Controle químico; Eucalyptus; LAMP; Nicho endofítico
O fungo Chrysoporthe cubensis, além de causar cancro em árvores, também foi relatado em minicepas de eucalipto causando murcha, a qual progride para a seca parcial ou total da copa das plantas. Considerando o limitado conhecimento sobre a murcha de Chrysoporthe em minicepas, os objetivos deste estudo foram: (1) confirmar a identidade do patógeno por meio de análises filogenéticas usando um número maior de isolados; (2) determinar se Chrysoporthe sp. ocupa um nicho endofítico em mudas assintomáticas e minicepas de eucalipto; (3) avaliar a disseminação da doença de minicepas sintomáticas para miniestacas e mudas; (4) avaliar a sensibilidade do patógeno a fungicidas triazóis e a eficácia dessas moléculas no controle da doença em eucalipto, tanto preventiva quanto curativamente; e (5) desenvolver a técnica de LAMP para detectar Chrysoporthe spp. A partir dos 42 isolados selecionados obtidos de minicepas assintomáticas e sintomáticas, 41 foram identificados como C. cubensis, enquanto um isolado, obtido de minicepa sintomática, foi identificado como Chrysoporthe doradensis, o que consistiu no primeiro relato de desta espécie em minicepa de eucalipto no mundo. A disseminação da doença por meio da propagação vegetativa, a partir de minicepas para miniestacas e para mudas, não foi confirmada. Chrysoporthe sp. não pôde ser recuperado de mudas de eucalipto oriundas de miniestacas enraizadas coletadas de minicepas sintomáticas. O teste EC50 mostrou que os isolados de C. cubensis são altamente sensíveis aos fungicidas triazóis em baixas doses: ciproconazol (0,0770 µg/mL), difenoconazol (0,0065 µg/mL), ipconazol (0,0868 µg/mL) e tebuconazol (0,0376 µg/mL). A aplicação de fungicidas no caule das minicepas não resultou em sintomas macroscópicos de fitotoxicidade. A aplicação curativa de fungicidas (72 h após a inoculação do patógeno) resultou em uma lesão necrótica no caule 26,94% menor em comparação com a aplicação preventiva (72 h antes da inoculação do patógeno) para todos os fungicidas testados. A aplicação das moléculas 15 dias após a inoculação do patógeno foi ineficaz no controle da doença. No entanto, os fungicidas ipconazol e tebuconazol foram capazes de reduzir o número médio de corpos de frutificação na superfície do caule em 53,7% e 56,9%, respectivamente. Para o ensaio de LAMP, um conjunto de primers (FIP, BIP, B3 e F3) foi desenvolvido com base no gene TEF 1a. As condições ótimas para amplificação foram uma proporção de 2:1 de primers FIP/BIP para F3/B3, temperaturas de 65 e 68 °C e tempos de incubação de 75 e 90 minutos. Para a reação positiva, a cor da reação mudou de rosa para amarelo. O conjunto de primers foi capaz de detectar C. cubensis e C. doradensis. Nenhuma amplificação de fungos não-alvo, como Botrytis sp., Fusarium sp. e Trichoderma sp., foi observada, fornecendo evidências de especificidade para espécies de Chrysoporthe. Este estudo traz importantes atualizações sobre a detecção de Chrysoporthe spp., etiologia e o controle da murcha de Chrysoporthe em minicepas de eucalipto que contribuem para mitigar o impacto da doença em minijardins clonais. Palavras-chave: Chrysoporthe cubensis; Chrysoporthe doradensis; Controle químico; Eucalyptus; LAMP; Nicho endofítico
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Citation
ANDRADE, Priscila Raiane Assunção de. Chrysoporthe wilt in eucalyptus min-stumps: detection, identification of the pathogen, and efficacy of triazole fungicides for disease management. 2025. 102 f. Tese (Doutorado em Fitopatologia) - Universidade Federal de Viçosa, Viçosa. 2025.