Toxicity of the fungicide difenoconazole and the herbicide tebuthiuron on honey bees and stingless bees across exposure pathways and multiple endpoints

Abstract

Bees are key pollinators of native flora and agricultural crops, contributing significantly to global food security and ecosystem functioning. The extensive application of agrochemicals has been associated with population declines in multiple bee species in recent decades. While bee diversity is considerable, toxicological research has largely centered on the honeybee (Apis mellifera), resulting in limited understanding of the ecotoxicological effects on other bees, like stingless bees (Meliponini). This study aimed to evaluate the effects of the agrochemicals difenoconazole and tebuthiuron exposure on different parameters on bees, including the Africanized honey bee A. mellifera and the native stingless bees Scaptotrigona xanthotricha and Partamona helleri. Oral and topical exposure were performed, followed by assessments of mortality, food consumption, oxidative stress, through biochemical markers, and histological analyses of the midgut to better understand the impact of these compounds on pollinator health and physiology. Tebuthiuron reduced P. helleri survival both oral and topical exposure. A. mellifera showed reduced diet intake during exposure to tebuthiuron via both exposure routes. However, no change in intake was observed after six hours after topical exposure to tebuthiuron or during the six ours-oral exposure to difenoconazole. P. helleri exhibited reduced diet intake only after oral exposure to tebuthiuron, but showed increased intake following exposure to difenoconazole. In contrast, S. xanthotricha demonstrated increased diet intake after both oral and topical exposure to difenoconazole, although no increase was observed during the initial six hours-oral exposure. Dose-response relationships followed power functions, with tebuthiuron consistently showing higher baseline toxicity but shallower slopes than difenoconazole. Enzyme-activity markers exhibited exposure-dependent responses. In A. mellifera, catalase (CAT) decreased after both exposures, while superoxide dismutase (SOD) and glutathione-S-transferase (GST) decreased after topical exposure. S. xanthotricha showed increased SOD and CAT but decreased GST after oral exposure; topical exposure increased SOD and decreased GST. P. helleri had increased SOD levels after oral exposure and elevated Malondialdehyde (MDA) and reduced nitric oxide after topical exposure. Midgut morphology was altered only in P. helleri, with tebuthiuron reducing microvilli height and both agrochemicals increasing nuclear area. Our study reveals striking interspecific differences in pesticide sensitivity among bees. Feeding behavior and biochemical markers further highlighted species-specific responses. A. mellifera displayed pesticide avoidance for tebuthiuron and CAT suppression, whereas S. xanthotricha upregulated detoxification enzymes. P. helleri suffered midgut damage, underscoring its risk. These findings challenge the use of A. mellifera as the sole model for pesticide risk assessment, particularly for Neotropical stingless bees. The results highlight the importance of incorporating multiple variables such as different exposure routes, concentrations, and species-specific responses, in agrochemical risk assessments to evaluate their effects on pollinators, including native species. Keywords: ecotoxicology; bees; sublethal effects; fungicide; herbicide; agrochemicalsAs abelhas são polinizadores fundamentais da flora nativa e das culturas agrícolas, contribuindo significativamente para a segurança alimentar e para o funcionamento dos ecossistemas. A aplicação extensiva de agroquímicos tem sido associada ao declínio populacional de várias espécies de abelhas nas últimas décadas. Embora a diversidade de abelhas seja considerável, a investigação toxicológica é centrada na abelha melífera (Apis mellifera), resultando numa compreensão limitada dos efeitos ecotoxicológicos em outras abelhas, incluindo as sem ferrão (Meliponini). Este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos da exposição (tópica ou oral) dos agroquímicos difenoconazol e tebutiuron em diferentes parâmetros em abelhas, incluindo A. mellifera e as abelhas nativas Partamona helleri e Scaptotrigona xanthotricha. Foram efetuadas exposições orais e tópicas, seguidas de avaliações de mortalidade, quantidade de ingestão de dieta, de atividade de enzimas responsivas a estresse e morfologia do intestino médio para compreender o impacto dos dois ingredientes ativos na saúde e fisiologia das abelhas. O tebutiuron reduziu a sobrevivência de P. helleri tanto por via oral como tópica. A. mellifera apresentou uma redução na ingestão de alimentos durante a exposição ao tebutiuron por ambas as vias de exposição. No entanto, não foram observadas tais alterações seis horas após a exposição tópica ao tebutiuron ou durante as seis horas de exposição oral ao difenoconazol P. helleri apresentou uma redução da ingestão apenas após a exposição oral ao tebutiuron, mas registrou um aumento da ingestão após a exposição ao difenoconazol. Em contrapartida, S. xanthotricha ingeriu mais dieta após exposição oral e tópica ao difenoconazol, embora não tenha sido observado qualquer aumento de ingestão durante as seis horas iniciais de exposição oral. As relações dose-resposta seguiram funções de potência, com o tebutiuron apresentando uma toxicidade de base mais elevada, mas declives menos acentuados do que o difenoconazol. Os marcadores de atividade enzimática apresentaram respostas dependentes da exposição. Em A. mellifera, a atividade da catalase (CAT) diminuiu após ambas as exposições, enquanto as atividades da superóxido dismutase (SOD) e a glutationa-S-transferase (GST) diminuíram após a exposição tópica. S. xanthotricha apresentou aumento de atividade de SOD e CAT e uma diminuição da atividade de GST após exposição oral. A exposição tópica aumentou a atividade de SOD e diminuiu a de GST. P. helleri registou um aumento dos níveis de SOD após exposição oral e um aumento do malondialdeído (MDA) e uma redução dos níveis de óxido nítrico após exposição tópica. A morfologia do intestino médio foi alterada apenas em P. helleri, com o tebutiuron reduzindo a altura das microvilosidades. Porém, a exposição a ambos agroquímicos aumentou a área nuclear das células digestivas. Nosso estudo revela diferenças interespecíficas marcantes na sensibilidade aos agroquímicos entre as abelhas. O comportamento alimentar e os marcadores bioquímicos evidenciaram ainda mais as respostas específicas de cada espécie. A. mellifera reduziu a ingestão de dieta contaminada com tebutiuron e supressão da CAT, enquanto a S. xanthotricha aumentou a regulação das enzimas de desintoxicação. P. helleri sofreu danos no intestino médio, evidenciando o seu risco. Estes resultados mostram as limitações quanto à utilização de A. mellifera como único modelo para a avaliação de risco a agroquímicos, particularmente para as abelhas sem ferrão. Os resultados reforçam a importância de incorporar múltiplas variáveis, como diferentes rotas de exposição, concentrações e respostas específicas de espécies, nas avaliações de risco para avaliar com mais precisão os efeitos dos agroquímicos nos polinizadores, incluindo espécies nativas. Palavras-chave: ecotoxicologia; abelhas; efeitos subletais; fungicida; herbicida; agroquímicos