Ciências Biológicas e da Saúde
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Item Relação entre fatores climáticos, casos de dengue e focos de Aedes aegypti e Aedes albopictus e seus criadouros(Universidade Federal de Viçosa, 2020-07-31) Barbosa, Bruno Franklin; Zanuncio, José Cola; http://lattes.cnpq.br/2006563344380705Aedes aegypti (Linnaeus) e Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae) são vetores de arboviroses, como a dengue, em diferentes regiões do mundo. Um total de 1.544.987 casos da doença foi notificado no Brasil em 2019. O objetivo foi correlacionar o número de focos de Aedes spp., expressados pelo índice de Breteau, com o número de casos de chikungunya, dengue, Zika vírus e clima, e identificar os principais tipos de criadouros desses vetores em Viçosa, Minas Gerais, Brasil. Os dados, de focos de culicídeos, foram obtidos dos levantamentos rápidos de índice para A. aegypti (LIRAa), realizados pela vigilância ambiental de Viçosa, de 2016 à 2018. Casos de chikungunya, dengue e Zika vírus foram obtidos do banco de dados online da secretaria de saúde de Minas Gerais, e os dados metereológicos da estação climatológica principal de Viçosa. Os índices de Breteau (IB), foram analisados, por correlação de Pearson (r), com o total de casos de chikungunya, dengue, Zika vírus, valores de precipitação e de temperatura. Índices de Breteau, de infestação predial e de tipo de recipente foram calculados para cada LIRAa. Resultados: Trezentos e sessenta e sete focos de culicídeos foram identificados, sendo 206 de A. aegypti, 117 de A. albopictus e 44 de outros culicídeos não vetores de arboviroses. O IB não foi correlacionado com o número de notificaçõe de chikungunya, dengue e Zika vírus (r= -0,27) e a temperatura (r= 0,26), mas teve correlação positiva com a precipitação (r= 0,86). A principal classe de criadouros de A. aegypti e A. albopictus foi tonéis e barris. A ausência de correlação entre IB e casos de dengue indica variação espacial e temporal entre a densidade populacional desses vetores e o monitoramento da vigilância. Correlação entre IB e precipitação demonstra a influência da chuva na taxa de eclosão e abundância desses vetores. Tonéis e barris foram os principais criadouros para os vetores da dengue. Palavras-chave: Dengue. Epidemiologia. Vetores de doença. Vigilância em Saúde Pública.Item Proteína recombinante NS1 de vírus dengue para diagnóstico(Universidade Federal de Viçosa, 2019-06-25) Xisto, Mariana Fonseca; Paula, Sérgio Oliveira de; http://lattes.cnpq.br/3130864308540955A dengue é uma doença que está presente em mais de 120 países, respondendo por 3,9 bilhões de pessoas em risco de infecção em todo o mundo. É uma doença viral transmitida por mosquito do gênero Aedes de grande potencial abrangente, podendo resultar em epidemias que ameaçam a saúde pública global. A transmissão contínua deles está intimamente ligada à emergência do quadro graves da febre hemorrágica e síndrome do choque que causam de altos índices letais da doença. O Dengue virus (DENV) pertence à família Flaviviridae, tem genoma de RNA fita simples, polaridade positiva e possui 4 sorotipos. A proteína não-estrutural 1 (NS1) é a primeira proteína viral presente na circulação sanguínea de paciente infectados, e é utilizada como biomarcador para diagnóstico da doença. Por ser altamente imunogênica, anticorpos circulantes IgM e IgG anti-NS1 são encontrados no soro de pacientes na fase aguda de infecções primárias e secundárias. Com a falta de uma vacina com proteção eficaz contra os 4 sorotipos do vírus, o diagnóstico sorológico é a alternativa mais segura para o tratamento correto da doença. O fator limitante na fabricação de kits diagnósticos de dengue é a produção em larga escala da proteína não-estrutural 1 (NS1) que é utilizada como antígeno na captura de anticorpos do soro de pacientes infectados. No presente trabalho expressamos a proteína NS1 em dois organismos heterólogos diferentes: Arabidopsis thaliana e Pichia pastoris, e avaliamos a atividade antigênica quanto à capacidade de detecção de anticorpos anti-dengue. Os resultados indicam que as proteínas recombinantes são candidatas promissoras para formulação de kit diagnóstico para dengue e testes de detecção rápida, devido ao alto rendimento, integridade antigênica e custo reduzido para produção em escala industrial.Item Análise descritiva de uma epidemia de dengue: a triagem como instrumento de redução de danos(Universidade Federal de Viçosa, 2018-04-19) Oliveira, Maria Augusta Coutinho de Andrade; Andrade, Filipe Moreira de; http://lattes.cnpq.br/7667998041595280Introdução: Apesar de a dengue ser uma doença endêmica em mais de 100 países, continua a ser negligenciada. Este estudo realizou a análise descritiva de uma epidemia através da aplicação de um instrumento específico para triagem de pacientes apresentando sintomas sugestivos de diagnóstico de dengue no serviço ambulatorial de atendimento exclusivo do sistema de saúde de Ubá, Minas Gerais, Brasil. Métodos: Trata-se de um estudo descritivo, transversal, observacional. Os dados foram obtidos através da análise de prontuários, mais especificamente a ficha de acolhimento e triagem. A associação entre dengue e comorbidades foi verificada através da regressão de Poisson, adotando-se α=0,05. Resultados: Dos 1260 indivíduos analisados, 73,84% foram identificados como sintomáticos para dengue e 39,59% apresentaram sinais de alarme. A busca pelo serviço de saúde se deu em média após 3 dias(± 2,3) do início dos sintomas. Em todas as faixas etárias, observou-se a presença de vômitos persistentes e dor abdominal; entre 20-39 anos verificou-se a presença de todos os sinais de alarme. Na triagem com classificação de risco obteve-se a prevalência do grupo B. Entre o total de comorbidades e condições clínicas observados, a hipertensão (9,68%) e idosos acima de 65 anos (4,25%) foram os mais comuns, respectivamente. Conclusões: O instrumento utilizado no estudo, revelou-se uma ferramenta eficaz para o enfrentamento de novas epidemias de dengue na região, sendo necessária a atenção aos sinais de alarme mais frequentes, a não subestimação dos sinais e sintomas de doenças transmitidas pelo Aedes Aegypti de modo a promover o diagnóstico rápido e correto.Item Expressão das proteínas não-estrutural 1 (NS1) dos vírus Dengue-1, Dengue-3 e Dengue-4 em Pichia pastoris(Universidade Federal de Viçosa, 2017-07-20) Prates, John Willians Oliveira; Paula, Sérgio Oliveira de; http://lattes.cnpq.br/9971532587279026A dengue é uma doença amplamente distribuída pelo mundo, e representa um grande problema de saúde pública em vários países. As manifestações clínicas podem variar desde uma síndrome viral inespecífica e benigna, até um quadro grave e fatal de doença hemorrágica com choque. O diagnóstico na sua fase inicial é muito importante, pois auxilia no tratamento sintomático do paciente e na adoção de medidas para o controle do vetor, prevenindo a dispersão da doença. Nesse contexto, a detecção de antígenos virais, especialmente a proteína não estrutural 1 (NS1), é uma alternativa muito eficaz para realizar o diagnóstico da dengue. Essa proteína é sintetizada pelas células infectadas, podendo ser detectada nos sobrenadantes das culturas ou no soro de pacientes infectados. Dessa forma, ela pode ser utilizada como antígeno para o desenvolvimento de kits de diagnóstico. No entanto, um grande problema no desenvolvimento de tais kits, consiste na obtenção desses antígenos, que geralmente é realizado por métodos caros, trabalhosos e de difícil execução. Nesse contexto, objetivou-se nesse trabalho utilizar um sistema de expressão eucariótico para produzir as proteínas NS1 dos vírus dengue-1, -3 e -4, e avaliar a sua antigenicidade. O gene otimizado da proteína NS1 do vírus dengue-4 foi clonado no plasmídeo pPICZαA, o qual foi utilizado para transformar leveduras Pichia pastoris por eletroporação. Posteriormente,a levedura transformada foi submetida á indução da expressão da proteína NS1. Outras duas leveduras transformadas, de maneira independente, com dois plasmídeos diferentes (pPICZαA/NS1DENV1 e pPICZαA/NS1DENV3) também foram induzidas a expressar as proteínas NS1 dos vírus dengue-1 e dengue-3. Proteínas de 60 kDa (NS1 DENV4), e duas de 50 kDa (NS1 DENV-1 e NS1 DENV-3) foram obtidas. Essas proteínas mostraram-se antigênicas no teste de Western Blot, demonstrando o seu potencial para serem utilizadas como antígenos para aplicações diagnósticas.Item Hemaglutinação passiva para detectar imunoglobulina humana antidengue(Universidade Federal de Viçosa, 2003-03-13) Henriques, Dyana Alves; Mezencio, Jose Mario da Silveira; http://lattes.cnpq.br/9817133193510065A dengue é uma doença febril, exantemática aguda considerada a mais importante arbovirose que afeta o homem. O diagnóstico laboratorial da dengue é realizado após suspeita clínica e as técnicas imunoenzimáticas, principalmente ELISA, são as mais difundidas, detectando anticorpos das classes IgM e IgG. Este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de uma técnica de hemaglutinação passiva de fácil execução, rápida e eficiente na detecção de anticorpos antidengue em sangue humano total. As próprias hemácias do paciente foram utilizadas como antígeno figurado, sendo o anti- soro contra hemácias humanas produzido em coelhos e purificado por precipitação e cromatografia. As imunoglobulinas G obtidas foram digeridas com o uso de papaína para a obtenção de fragmentos Fab. Após a separação, os fragmentos foram ligados às partículas virais de dengue, previamente purificadas em gradiente de densidade contínuo de tartarato de sódio e potássio, utilizando o glutaraldeído como agente acoplador. Demonstrou-se que a estratégia de conjugação dos fragmentos Fab à partícula viral é factível com uso de glutaraldeído, contudo, há necessidade do desenvolvimento de estudos para a verificação do grau de eficiência de conjugação. O método de conjugação adotado não impediu os fragmentos Fabs de se ligarem às hemácias e nem os anticorpos antidengue de reconhecerem seus epítopos na partícula viral. A utilização de anticorpos monoclonais, ou sistemas de expressão para proteínas virais assim como para fragmentos de anticorpos facilitariam as etapas de montagem do conjugado, além de otimizar o funcionamento da técnica. Em conclusão, a detecção de anticorpos antidengue em amostras de soro e hemácias foi possível a partir do método proposto.Item Desenvolvimento e avaliação da imunogenicidade de uma vacina de DNA tetravalente combinada com adjuvantes genéticos contra os vírus dengue(Universidade Federal de Viçosa, 2016-06-28) Pessoa, Carine Ribeiro; Paula, Sérgio Oliveira de; http://lattes.cnpq.br/6614821404457684A dengue é a mais importante arbovirose que afeta o homem e o aumento crescente de casos nas áreas endêmicas bem como a possível expansão da área de risco de infecção tem causado preocupação em todo o mundo. Atualmente, as medidas de controle da doença são baseadas no controle do vetor, mosquitos do gênero Aedes sendo que estas não se mostraram eficientes, uma vez que o número de infecções aumentaram cerca de 30 vezes nos últimos 50 anos. Os vírus dengue possuem quatro sorotipos DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4 e uma infecção com um sorotipo promove imunidade protetora contra infecções com o mesmo sorotipo. Numa segunda infecção com um sorotipo heterólogo, os anticorpos não-neutralizantes produzidos na primeira infecção podem aumentar o número de células infectadas e assim, exacerbar a resposta imune. Esse fenômeno, conhecido por ADE (antibody dependent enhancement) está relacionado com as formas graves da doença e por essa razão, uma vacina eficiente contra dengue deve ser tetravalente. Este trabalho tem o objetivo de construir uma vacina de DNA tetravalente contra a dengue e, adicionalmente desenvolver adjuvantes genéticos para aprimorar a imunogenicidade dessa vacina. Para isso, as sequências de DNA correspondentes ao domínio III da proteína E dos quatro sorotipos dos vírus da dengue foram clonadas num mesmo vetor de expressão. Para o desenvolvimento de adjuvantes genéticos, genes das citocinas GM-CSF, IL-7 e IL-15 foram clonados separadamente em plasmídeo de expressão de modo que diferentes associações dos adjuvantes genéticos pudessem ser avaliadas com o plasmídeo vacinal. A avaliação da imunogenicidade da vacina de DNA tetravalente e sua associação com os diferentes adjuvantes mostrou que houve uma resposta linfoproliferativa contra as proteínas prM e E recombinantes de DENV-3, sendo os esplenócitos oriundos dos grupos que receberam pVAX-EDIII1-4 e pVAX-IL15, pVAX-EDIII1-4 e pVAX-GMCSF e pVAX-EDIII1-4, pVAX-GMCSF e pVAX-IL7 apresentaram maior resposta quando re-estimulados in vitro. Também foi observado um aumento no número de células B nos grupos vacinados com pVAX-EDIII1-4 e pVAX-GMCSF e pVAX-EDIII1-4, pVAX-GMCSF e pVAX- IL15. Na subpopulação de células T CD4 houve incremento no grupo imunizado com pVAX-EDIII1-4 e GMCSF e as células T CD8, no grupo imunizado com pVAX- EDIII1-4 e pVAX-IL7. Observou-se um aumento na subpopulação de linfócitos T CD8 CD44+ CD62L- (TEM-memória efetora) nos grupos imunizados com pVAX-EDIII1-4 e pVAX-IL7 e pVAX-EDIII1-4, pVAX-GMCSF e pVAX-IL7. Em relação à memória central (TCM - CD44+ CD62L+) T CD4 e T CD8 o maior aumento se deu no grupo imunizado com pVAX-EDIII1-4, pVAX-GMCSF e pVAX-IL15. As células naïve T CD4 e T CD8 também estão aumentadas no grupo imunizado com pVAX-EDIII1-4, pVAX-GMCSF e pVAX-IL15. No ensaio de neutralização in vivo com DENV-2, observou-se 60% de proteção nos animais que tiveram o vírus neutralizado com o soro dos animais vacinados com o pVAX-EDIII1-4 e pVAX-IL7; 40% de proteção nos animais que tiveram o vírus neutralizado pelo soro dos animais vacinados com o pVAX- EDIII1-4; pVAX-EDIII1-4, pVAX-GMCSF e pVAX-IL7; pVAX-EDIII1-4, pVAX- GMCSF e pVAX-IL15. No mesmo ensaio utilizando DENV-1, podemos observar que o grupo cujo vírus foi neutralizado com o soro dos animais vacinados com pVAX-EDIII1- 4 e pVAX-IL7 a sobrevivência foi de 80% e de 60% nos grupos que receberam o vírus neutralizado com o soro dos animais vacinados com apenas o pVAX-EDIII1-4, pVAX- EDIII1-4 e pVAX-GMCSF, pVAX-EDIII1-4, pVAX-GMCSF e pVAX-IL7 e pVAX- EDIII1-4, pVAX-GMCSF e pVAX-IL15. Esses resultados mostram que a vacina foi capaz de induzir uma resposta imune e que os adjuvantes testados auxiliaram essa resposta.Item Avaliação imunológica de um candidato vacinal de DNA recombinante contra o vírus Dengue-2(Universidade Federal de Viçosa, 2009-07-23) Paula, Marília Barbosa de; Paula, Sérgio Oliveira de; http://lattes.cnpq.br/0336768036919414O Dengue vírus, membro da família Flaviviridae, é o agente etiológico da dengue e é transmitido através da picada do mosquito Aedes aegypti. Até o momento não existe tratamento específico, e o controle da doença baseia-se na tentativa de conter o mosquito vetor, desse modo a Organização Mundial de Saúde considera de extrema importância o desenvolvimento de uma vacina eficaz contra esta doença. Neste contexto, foi construído um candidato vacinal pCID2Et expressando a proteína E truncada do vírus dengue-2, sem a expressão concomitante de prM. Testes demonstraram correta, porém reduzida expressão de E, e apenas uma pequena porcentagem de camundongos imunizados foi protegida quando desafiados com vírus dengue-2. Estes resultados justificam o aprimoramento desta construção vacinal, buscando o aumento da expressão de proteína E e assim proporcionar uma imunização mais eficaz. Desse modo, nosso objetivo foi aprimorar este plasmídeo através da inserção das proteínas prM/DENV-2 e prM/DENV-3. Neste ínterim foram construídos dois plasmídeos pCID2EtprMD2 e pCID2EtprMD3, cujas análises bioquímicas já realizadas indicaram aumento de expressão relativo de proteína E de 67,02% por pCID2EtprMD3 com relação a pCID2EtprMD2. Para avaliar os efeitos da expressão aumentada de proteína E na imunogenicidade dos plasmídeos foi realizada a avaliação imunogênica dos mesmos. Os plasmídeos pCID2EtprMD3, pCID2EtprMD2 e pCID2Et foram utilizados na imunização de camundongos e os resultados demonstraram que pCID2EtprMD3 apresentou maior indução do sistema imune, tanto em relação à expressão de células TCD4 + e TCD8 + de memória quanto em relação à secreção de anticorpos específicos para a proteína E.Item Expressão heteróloga da proteína não-estrutural 1 (NS1) do vírus dengue-2 em Arabidopsis thaliana(Universidade Federal de Viçosa, 2015-07-30) Xisto, Mariana Fonseca; Paula, Sérgio Oliveira de; http://lattes.cnpq.br/3130864308540955A dengue é a doença mais importante causada por um arbovírus no mundo. O vírus da dengue pertence à família Flaviviridae e possui 4 sorotipos antigenicamente distintos. São vírus de RNA fita simples, polaridade positiva, com o genoma de aproximadamente 11 Kb que é traduzido em uma poliproteína subdividida em três proteínas estruturais e sete proteínas não- estruturais (que estão relacionadas com a replicação viral, expressão das proteínas virais e virulência dos sorotipos). Nos últimos vinte anos têm sido observado um incremento significativo na atividade epidêmica, expansão da distribuição geográfica e transmissão contínua dos diferentes sorotipos em áreas onde a doença não era prevalente. Um dos eventos mais alarmantes tem sido o aumento do número de casos da Febre da Dengue Hemorrágica (FDH) nas Américas. Um ponto ainda limitante dos testes diagnósticos que capturam o anticorpo presente no soro de pacientes infectados consiste na dificuldade de obtenção de baixo custo e produção em grande escala dos antígenos. Diante destas considerações objetivou-se expressar a proteína não-estrutural (NS1) do vírus dengue-2 em plantas transgênicas de Arabidopsis thaliana. O gene da proteína NS1 foi otimizado para a expressão em plantas e clonado no plasmídeo pCAMBIA3301. O vetor de expressão pCAMBIA3301/NS1 foi utilizado para transformação de Arabidopsis thaliana. A terceira geração de plantas transformadas foi selecionada em homozigose dominante. A transformação de Arabidopsis thaliana foi evidenciada pela imunolocalização da proteína NS1 marcada dentro do lúmen do retículo endoplasmático em tecidos foliares. Este sistema será utilizado para obtenção do antígeno NS1 com finalidade de aplicação em testes de diagnóstico da dengue.Item Construção de uma linhagem recombinante de Kluyveromyces marxianus UFV-3 para expressão da proteína não estrutural (NS1) do vírus da dengue-1(Universidade Federal de Viçosa, 2013-03-15) Bragança, Caio Roberto Soares; Passos, Flávia Maria Lopes; http://lattes.cnpq.br/4727682406077541A levedura Kluyveromyces marxianus tem sido considerada uma candidata hospedeira para a síntese industrial de biomoléculas. Apesar de seu potencial, são poucos os estudos que relatam a expressão de proteínas heterólogas utilizando esta levedura. Neste trabalho, foi relatado pela primeira vez, a expressão da proteína do vírus da dengue em K. marxianus. O gene que codifica a proteína não estrutural (NS1) do vírus da dengue-1 foi integrado no genoma da levedura K. marxianus UFV-3 no locus LAC4, utilizando um vetor integrativo adaptado projetado para expressão de proteínas recombinantes em Kluyveromyces lactis. O gene de dengue-1 NS1 foi otimizado utilizando os códons preferenciais para aumentar os níveis de expressão de proteínas em leveduras. O gene sintético foi clonado “in frame” com o peptídeo sinal (mating-α-factor) de K. lactis e o plasmídeo recombinante obtido foi utilizado para transformar K. marxianus UFV-3 por eletroporação. As células transformantes selecionadas em YPD (yeast extract peptone dextrose) contendo 200 ug mL-1 de geneticina foram mitoticamente estáveis. A análise das linhagens recombinantes por meio de RT-PCR e a detecção da proteína utilizando Dot-blot confirmou a transcrição e a expressão dos peptídeos extracelulares. Após a indução com galactose, a proteína NS1 foi analisada por SDS-PAGE e Western blot. A produção da proteína foi investigada sob duas condições: com pulso de galactose e biotina com intervalos de 24 horas durante 96 horas após a indução e sem pulso de galactose e biotina. A atividade proteolítica não foi detectada no sobrenadante das culturas. Nossos resultados indicam que células recombinantes de K. marxianus podem ser consideradas boas hospedeiras para a produção de proteínas do vírus de dengue, que têm um potencial para aplicações em diagnósticos.Item Análise do uso de nanotubos de carbono como veículos para aprimorar a transfecção de um candidato vacinal de DNA contra o vírus da dengue(Universidade Federal de Viçosa, 2015-03-30) Calegari, Luan Prados; Paula, Sérgio Oliveira de; http://lattes.cnpq.br/4788161979827841As infecções causadas pelos vírus dengue representam a principal arbovirose em nível mundial e são de grande importância para o nosso país. O controle desta doença se baseia na tentativa de eliminar os mosquitos transmissores, pois não existem vacinas disponíveis comercialmente para este vírus, o qual é representado por quatro sorotipos diferentes. Pesquisas recentes com desenvolvimento de vacinas contra a dengue têm explorado o uso de expressão de antígenos recombinantes em vetores de expressão, chamados vacinas de DNA. Recentemente tem sido estudado o uso de nanotubos de carbono para aplicações na área biológica, como transporte e disponibilização de drogas, proteínas e genes em células. No presente estudo foi utilizado um candidato vacinal de DNA tetravalente contra a dengue, o qual possui genes para a expressão do domínio III da proteína E dos quatro sorotipos do vírus. Foi feita a conjugação do mesmo com nanotubos de carbono de paredes múltiplas e foi verificado quanto a sua expressão tanto em cultura de células como em modelos animais, com avaliação do padrão de resposta imunológica gerado. Pelos resultados obtidos foi possível observar que o candidato vacinal de DNA tetravalente desenvolvido obteve uma resposta pouco satisfatória quando testado in vitro e in vivo, uma vez que o único resultado interessante foi com relação ao aumento de células B e a produção de citocinas pró-inflamatórias IFN- γ e IL-6. Além disso, foi demonstrado que a conjugação do candidato vacinal com o MWCNT não gerou aumento da resposta imune nos camundongos, sendo que o único resultado obtido foi um aumento de células B quando os camundongos foram tratados com esse composto.