Ciências Biológicas e da Saúde
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Item Interação de genótipos de soja com Helicotylenchus dihystera(Universidade Federal de Viçosa, 2019-02-20) Xavier, Yan Pablo Moreira; Costa, Maximiller Dal Bianco Lamas; http://lattes.cnpq.br/0297028341324221A soja é uma commodity de grande importância para o agronegócio brasileiro. Manter a alta produtividade é um problema, principalmente devido as perdas acarretadas por fitonematoides durante o ciclo da soja. Dentre os fitonematoides secundários da soja, se destaca o Helicotylenchus dihystera. Entretanto, não se conhece os danos causados por este nematoide na cultura, e até o presente momento, não há genótipos de soja identificados com genes de resistência ao gênero Helicotylenchus, bem como os mecanismos envolvidos nesse processo. O presente trabalho teve como objetivo selecionar marcadores SNPs relacionados à resistência de plantas de soja a H. dihystera e confirmar a resistência dos genótipos de soja por fenotipagem. Como resultado, nenhuma das cultivares apresentou resistência, entretanto, a cultivar TMG 1176 RR apresentou diferença estatística em relação ao fator de reprodução de cultivares altamente susceptíveis. Foram encontradas 21 SNPs associadas ao fator de reprodução presente em nove cromossomos da soja. Deste total, foram encontradas 11 SNPs associadas com o parasitismo de outros fitonematoides em soja já descritos na literatura. Em nosso trabalho foi possível conhecer o grau de reação de susceptibilidade de cada uma das cultivares por fator de reprodução e selecionar marcadores SNPs associados com a resistência de genótipos de soja à H. dihystera que poderão ser posteriormente utilizados em programas de melhoramento.Item Análise dos mecanismos de splicing alternativo em resposta ao déficit hídrico em soja (Glycine max)(Universidade Federal de Viçosa, 2019-07-29) Santos, Eulalio Gutemberg Dias dos; Ramos, Humberto Josué de Oliveira; http://lattes.cnpq.br/2633964026181142A soja [Glycine max (L.) Merr.] hoje em dia é uma das culturas de maior importância para o agronegócio mundial. O Brasil se posiciona como o segundo maior produtor mundial desta cultura, com mais de 30% da produção, atrás apenas dos Estados Unidos. Porém, nos últimos anos, a soja vem sofrendo grandes perdas em função das adversidades climáticas, apresentando enorme sensibilidade a alterações de frio, calor, chuvas e principalmente escassez hídrica, responsável pelas maiores perdas, impedindo uma maior produtividade e expansão agrícola para outras regiões. A solução para essas perdas seria o desenvolvimento de técnicas mais eficazes de plantio e produção, bem como o desenvolvimento de variedades genotípicas mais tolerantes à escassez hídrica. Dessa forma, nosso principal objetivo é a busca pela melhor elucidação de mecanismos e vias relacionadas ao estresse hídrico por predição em bioinformática analisando o transcriptoma após estresse. Portanto, estudos transcriptômicos oferecem uma visão dos mecanismos de resposta ao estresse das plantas. Aqui, apresentamos os resultados do perfil global de expressão gênica de folhas de dois cultivares de soja, BR16 e EMBRAPA48, com capacidade contrastante para lidar com o déficit hídrico, utilizando metodologia de sequenciamento de RNA. Para as análises iniciais do transcriptoma, a qualidade das sequências foi avaliada com o programa FastQC. Posteriormente, nós realizamos o alinhamento contra o genoma de referência da soja usando o alinhador Bowtie/TopHat, em seguida avaliado o perfil de expressão gênica pelo pacote Cufflinks/Cuffdiff, que mostraram uma gama de genes que foram alterados em função do estresse, com uma perturbação mais branda para a variedade mais tolerante EMBRAPA48. Nossa análise sugere que a tolerância à seca resulta de um certo nível de transcrição de genes que predispõem a planta mesmo antes do início da seca. No splicing alternativo diferentes éxons e íntrons de um mesmo pré- RNA mensageiro podem ser excluídos ou retidos para produzir diferentes RNAs maduros, expandindo o repertório do transcriptoma. Análises de expressão diferencial em nível de transcritos podem detectar alterações na expressão de isoformas do transcrito, a partir de um mesmo gene. Portanto, no presente estudo, nós avaliamos a ocorrência de ivsplicing alternativo diferencial. Inicialmente realizamos o alinhamento contra o genoma de referência de Soja usando o alinhador splice-aware STAR. Após o alinhamento, o programa rMATS foi usado para detectar os principais tipos de splicing alternativo. Em nossos resultados mostramos que o Alternativo 3’ e Skipped exon foram os eventos de maior ocorrência para ambas variedades. Nossos dados sugerem que eventos de splicing alternativo são diferencialmente regulados em consequência da submissão ao estresse hídrico e revelam um mecanismo potencial na regulação da expressão de genes com importantes funções na tolerância ao estresse. Diante das análises de Ontologia revelou que os genes DAS estavam envolvidos principalmente em processos biológicos, incluindo resposta celular ao estresse como a biossíntese de polissacarídeos de membrana (dentre as quais se encontram a biossíntese de glicanos, betaglicanos e UDP-raminose), reparo da região 3’ de DNA, transporte de auxina, regulação do desenvolvimento floral e resposta ao estímulo abiótico como manutenção do potencial hídrico das folhas. Dessa forma a avaliação da expressão de genes e do splicing alternativo do transcriptoma de soja para as variedades contrastantes nos fornecem entendimento de como ocorre a regulação da expressão diferencial bem como a descrição de mecanismos e vias para tolerância ao estresse hídrico.Item Interação funcional, expressão de genes e filogenia entre proteínas de membrana de Rickettsia spp. e carrapatos(Universidade Federal de Viçosa, 2019-07-02) Gomes, Gabriel Guimarães; Siqueira, Cláudio Lísias Mafra deA interface da relação parasito-hospedeiro entre carrapatos e espécies de Rickettsia endo simbiônticas é mediada por interações e mecanismos moleculares, ocorrendo através de genes e proteínas potencialmente codificadas nos genomas de ambos os organismos. Tratando-se de uma relação em nível molecular, buscamos predizer as interações, ativação da expressão de genes e coevolução entre os repertórios de proteínas destes organismos. Para avaliar a hipótese de interação, utilizamos sequências de proteínas de membrana devido a maior probabilidade de participar do processo de infecção. Estas sequências foram submetidas a abordagem de reconstrução do interatoma adotando como modelo, as proteínas provenientes dos genomas do Ixodes scapularis em resposta a infecção por Rickettsia amblyommatis. Com o auxílio de bancos de dados de interação proteína-proteína, utilizamos de métodos de alinhamentos de sequências e predição de domínios proteicos. Contra a base de dados PEIMAP, adotou-se do BLASTP. Para a base de dados SCOP, utilizada pelo PSIMAP, adotou-se o PSI-BLAST. Para a base de dados iPfam, utilizada pelo PFAM, adotou-se modelos ocultos de Markov. A partir disto, realizamos um cálculo de confiança assumindo independência entre os quatro métodos. Estes resultados foram concatenados e filtrados nos resultados do interatoma para a construção do interatoma de proteínas de membrana. As proteínas ortólogas e conservadas na rede do interatoma de proteínas de membrana foram avaliadas com o uso do aplicativo OrthoMcl adotando o BLASTP contra as proteínas do genoma de R. amblyommatis contra proteínas de outras espécies de Rickettsia. As proteínas ortólogas de membrana foram avaliadas quanto as características evolutivas através do método do Maximum Likelihood Tree para as inferências e construção de cladogramas e árvores de hipóteses filogenéticas. Em seguida, os resultados das redes do interatoma de proteínas de membrana e ortólogas serviram de base para realizamos a anotação de proteínas putativas provenientes de sequências de transcritos adquiridas com a montagem de novo do transcriptoma de glândulas salivares, intestinos e ovários de carrapatos. Os resultados das redes apresentaram estruturas fortemente modulares com altos números de componentes conexos. Esta análise de anotação das proteínas de interface da membrana de R. amblyommatis permitiu identificar famílias de proteínas sabidamente envolvidas na modulação da fisiologia da célula do carrapato I. scapularis. Os resultados obtidos para as análisesfilogenéticas destas proteínas sugerem haver divergências entre as espécies de Rickettsia que infectam carrapatos em relação a outras espécies encontradas em insetos, ou em outros hospedeiros correlacionados. A ocorrência da interação, os aspectos evolutivos e os níveis de expressão diferenciada de proteínas sugerem mecanismos moleculares conservados com maior capacidade de ocasionar mudanças nos padrões de expressão para as espécies de Rickettsia específicas ao carrapato em determinados órgãos e ou grupos de hospedeiros hematófagos com os quais, elas puderam coevoluir. Palavras-chave: Carrapatos. Rickettsia. Interatoma de Proteínas. Expressão de Genes. Filogenia de Proteínas de Membrana.Item Modelagem do metabolismo do café durante a infecção por Hemileia vastatrix em plantas susceptíveis e resistentes(Universidade Federal de Viçosa, 2018-07-13) Gazolla, Lizandra Cristina de Oliveira Figueiredo; Mendes, Tiago Antônio de Oliveira; http://lattes.cnpq.br/9315919781419081O Brasil é o país com a maior produção e exportação de café e as espécies mais cultivadas mundialmente são o Coffea arabica e o Coffea canephora. A doença do cafeeiro de maior relevância no cenário mundial é a ferrugem alaranjada, causada pelo fungo biotrófico Hemileia vastatrix. O principal sintoma é o aparecimento de manchas amareladas na parte abaxial das folhas e, em condições climáticas favoráveis, as perdas na lavoura podem chegar a 50% da produção. O cultivar Híbrido de Timor CIFC 832/2 tem sido uma importante fonte de genes de resistência para os programas de melhoramento. Entretanto, o alto potencial adaptativo do fungo e a própria pressão seletiva causada pela utilização de cultivares resistentes vem culminando no surgimento de diversas raças fisiológicas do fungo capazes de suplantar a resistência obtida através dos métodos clássicos de melhoramento. Uma nova abordagem no estudo da relação parasito-hospedeiro é a integração de dados de genômica e outras ômicas para a construção de um modelo metabólico. Através da análise de balanço do fluxo (FBA) é possível simular o papel de cada gene na célula auxiliando na compreensão da interação entre o cafeeiro e o fungo. Com isto, o presente trabalho propôs a construção de um modelo metabólico baseado no genoma seguido da análise de FBA para cultivares resistente e susceptível após a infecção por H. vastatrix. Os dados de transcriptomica foram integrados ao modelo original gerando modelos contexto- específicos. Essas análises indicaram um acúmulo de glicerol-3-fosfato (G3P) no Hibrido de Timor CIFC 832/2 sugerindo que o metabolismo primário contribui para a resistência do cafeeiro, uma vez que a participação deste metabólito na resposta imune adquirida de plantas já foi demonstrada.Item Desenvolvimento de uma plataforma de produção de glicoproteínas por expressão heteróloga de sialiltransferase e interferon-beta em Leishmania tarentolae(Universidade Federal de Viçosa, 2018-02-23) Senra, Renato Lima; Mendes, Tiago Antônio de Oliveira; http://lattes.cnpq.br/1786546008789832A produção de glicoproteínas terapêuticas possui alto custo devido à necessidade de utilização de cultura de células de mamíferos que dependem de meios de cultivo complexos e caros, além de possuírem baixo rendimento de produção. Leishmania tarentolae, um protozoário não patogênico para mamíferos, tem sido sugerido como um sistema alternativo para expressão heteróloga de glicoproteínas devido à existência de métodos eficientes de expressão heteróloga, ser facilmente adaptado para produção em alta escala de baixo custo. Além disso, este protozoário apresenta modificações pós- traducionais ausentes em bactérias e leveduras, organismos mais utilizados para produção industrial de proteínas recombinantes. Entre elas, a proteína interferon-β. Esta é uma molécula glicosilada utilizada no tratamento de doenças neurodegenerativas inflamatórias e autoimunes, como a esclerose múltipla e a artrite reumatoide. Embora o perfil de glicosilação de proteínas expressas em L. tarentolae seja semelhante ao de mamíferos, existem algumas diferenças no perfil de carboidratos presentes nas terminações das cadeias glicídicas devido à ausência de enzimas de biossínteses e incorporação de ácido siálico. A presente proposta de projeto, portanto, teve como objetivo o desenvolvimento de uma plataforma de expressão de interferon-β utilizando linhagens de L. tarentolae selvagem e geneticamente otimizadas para síntese de glicoproteínas com potencial incorporação de ácido siálico na extremidade da cadeia glicídica, proporcionando uma ação mais eficaz das proteínas e reduzindo os custos de produção. As abordagens utilizadas, que visaram entender mais sobre as vias metabólicas encontradas nestes organismos utilizando dados de genômica e metabolômica, indicaram uma alternativa de tornar o sistema de expressão em L. tarentolae mais otimizado pela expressão heteróloga de sialiltransferase, enzima ausente nestes organismos. As linhagens geneticamente modificadas foram obtidas por transfecção com genes otimizados para o gênero Leishmania. A integração das sequências heterólogas de sialiltransferase e IFN-β foi confirmada por PCR e pela presença de transcritos obtidos por RT-PCR. Ensaios de eletroforese em gel de poliacriamida e marcação de proteínas com anticorpos específicos (anti-his e anti-IFN-β) também confirmaram produção heteróloga de proteína nas linhagens selecionadas.Item Avaliação do potencial de sorodiagnóstico bovino de antígenos de Trypanosoma vivax contendo epítopos identificados por phage-display(Universidade Federal de Viçosa, 2018-02-23) Pereira, Higor Sette; Mendes, Tiago Antônio de Oliveira; http://lattes.cnpq.br/5802455114309894A pecuária bovina está diretamente relacionada ao crescimento econômico nacional, uma vez que esta atividade movimentou uma quantia superior a 400 bilhões de reais entre 2012 e 2017. Doenças como a tripanossomíase bovina, causada pelo protozoário Trypanosoma vivax, acometem os rebanhos acarretando enormes prejuízos à bovinocultura. Atualmente, o diagnóstico da doença é baseado na detecção do protozoário através de técnicas parasitológicas ou moleculares. No Brasil, a tripanossomíase bovina é considerada crônica e as técnicas disponíveis para o diagnóstico se mostram insuficientes para o controle e diagnóstico da patologia. Neste trabalho, técnicas de phage display, bioinformática e imunológicas foram utilizadas para identificar peptídeos e proteínas recombinantes com alta afinidade a anticorpos do soro de animais infectados. Dentre os peptídeos clones de fagos testados, 25 foram reativos com as amostras de bovinos infectados, sendo que 11 apresentaram valor máximo de sensibilidade e especificidade. Isto posto, utilizou-se da sequência dos fagos reativos para mapear proteínas de T.vivax e expressá-las em Escherichia coli. Duas proteínas foram identificadas, sendo que a Tv2 foi isolada, purificada e titulada com as amostras infectadas. Este screening inicial indicou que a proteína Tv2 possui potencial antigênico a ser explorado, visto que os valores de absorbância foram distintos entre as amostras saudáveis, as de animais infectados com demais patologias e de tripanossomíase bovina. Logo, faz-se necessário mais ensaios para avaliar e elucidar o potencial de diagnóstico da proteína Tv2.Item A superexpressão de GmbZIPE2 em protoplastos de soja sugere um papel regulador da expressão de genes da fotossíntese e da via de biossíntese de fenilpropanóides(Universidade Federal de Viçosa, 2018-11-30) Gonçalves, Amanda Bonoto; Fietto, Luciano Gomes; http://lattes.cnpq.br/9080276580537208A modulação da transcrição gênica é fundamental para a formação de uma resposta de defesa eficaz em plantas sob estresses. Os mecanismos de modulação são regulados principalmente por fatores de transcrição. A família de fatores de transcrição com domínio básico de zíper de leucina (bZIP) é relacionada com vários processos na planta, dentre eles a fotossíntese e estresse abiótico e biótico, e são divididos em 12 grupos em soja. GmbZIPE2 (Glyma05g168100) é um membro do grupo E da família bZIP de Glycine max, e membros desse grupo ainda não foram caracterizados nesta espécie. O gene GmbZIPE2 de soja tem sua expressão alterada em resposta à infecção fúngica e ao tratamento com fitormônios de defesa. A proteína GmbZIPE2 é capaz de se ligar ao cis- elemento H-box in vitro e ativar a transcrição da chalcona sintase CHS8, importante enzima da via de biossíntese de fenilpropanoides. Além disso, GmbZIPE2 interage com duas proteínas relacionadas à fotossíntese e estresse oxidativo. Neste estudo foi realizado o transcriptoma de protoplastos de folhas de soja superexpressando GmbZIPE2 a fim de se obter mais informações sobre a função desse fator de transcrição. A maior porcentagem de genes ativados pela superexpressão de GmbZIPE2 estão relacionados com fotossíntese. Um número expressivo de genes ativados são fatores de transcrição, dentre eles dois WRKY33, gene que é relacionado a indução da produção de fitoalexinas na defesa contra patógenos. Nossos resultados sugerem que GmbZIPE2 possui um papel regulador na via de biossíntese de fitoalexinas e na fotossíntese, mais especificamente, no controle de estresse oxidativo.Item Resposta ao estresse por etanol em Saccharomyces cerevisiae e Spathaspora passalidarum(Universidade Federal de Viçosa, 2019-04-26) Castro, Alex Gazolla de; Fietto, Luciano Gomes; http://lattes.cnpq.br/8390564540222644Micro-organismos, como leveduras, produzem etanol a partir da fermentação de açúcares. O estresse por etanol é um dos principais fatores limitantes para o processo industrial, uma vez que reduz a efciência fermentativa e a viabilidade celular. Nesta tese, nós avaliamos a tolerância ao etanol nas leveduras Saccharomyces cerevisiae e Spathaspora passalidarum. No primeiro estudo, foi avaliado o efeito da deleção do gene APJ1 na capacidade de crescimento de S. cerevisiae (linhagens BY4741 e Y02999) sob estresse por etanol. Apj1p é uma possível chaperona relacionada a tolerância ao etanol, embora seus mecanismos de ação ainda não sejam muito claros. Não foram observadas diferenças significativas nos ensaios de crescimento, tanto em meio sólido quanto em meio líquido, na presença de etanol. Além disso, a adaptação fisiológica a outros estresses (ácido acético, altas concentrações de glicose, pH e temperatura) é similar entre as linhagens em estudo. Assim, embora APJ1 tenha sido up-regulada sob estresse por etanol, esse gene não está intimamente associado à tolerância ao etanol nas linhagens estudadas. No segundo estudo, nós realizamos análises de genômica comparativa entre S. cerevisiae e S. passalidarum, a fim de compreender suas diferenças quanto a tolerância ao etanol. Análises de proteínas ortólogas revelaram amplas divergências entre elementos envolvidos no controle transcricional. Comparações sistemáticas indicaram que S. cerevisiae possui fatores de transcrição exclusivos, bem como cópias adicionais. Além disso, muitos alinhamentos de sequências entre fatores de transcrição ortólogos compartilharam baixa identidade. Em contraste, a reconstrução de vias de sinalização e a análise de proteínas responsivas ao etanol mostraram alta conservação entre mecanismos de tolerância ao etanol de S. cerevisiae e S. passalidarum. Por fim, a análise de expressão indicou que genes responsivos ao etanol, como TPS1, HSP30 e MSN-like, foram down- xiregulados em S. passalidarum sob estresse. Juntos, esses resultados indicam que a resposta ao estresse não é exclusivamente dependente de proteínas efetoras. Mais que isso, a adaptação efetiva é dependente de uma complexa rede de controle de expressão gênica, que é afetada por fatores de transcrição.Item Análises in silico das proteínas de superfície e secretadas de Staphylococcus aureus para discriminar entre as mastites bovina clínica e subclínica(Universidade Federal de Viçosa, 2018-02-26) Rocha, Lis Souza; Ribon, Andréa de Oliveira Barros; http://lattes.cnpq.br/6648940980655820Staphylococcus aureus é uma das principais bactérias causadoras da mastite bovina, uma doença predominante nos rebanhos leiteiros. A mastite bovina pode se manifestar de forma clínica, onde os sinais de inflamação são observados, ou de forma subclínica, sem sintomas aparentes, e que frequentemente evolui para a cronicidade. Os genomas de quatro isolados de S. aureus causadores de mastite bovina subclínica (170, 302, 1269, 1364) foram sequenciados por nosso grupo e foram contrastados com os genomas de duas cepas isoladas de mastite clínica (S. aureus RF122 e S. aureus N305) para identificar diferenças que pudessem ser ligadas à mastite subclínica. Não foi possível associar a presença de fatores de virulência ao tipo de manifestação. Mais genes relacionados à produção de enterotoxinas foram encontrados no genoma de S. aureus RF122. Os genes que codificam a toxina 1 da síndrome do choque tóxico (tsst-1), a variante bovina da enterotoxina C (secbov), a enterotoxina t e dois homólogos da streptolisina S de Streptococcus pyogenes foram exclusivos da cepa RF122. A presença de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) nos genomas subclínicos foi averiguada comparando 33 genes que codificam fatores de virulência com seus ortólogos em S. aureus RF122. SNPs não sinônimos foram encontrados nos genes clfa (fator de aglutinação A), srta (sortase A) e sspa (protease). Uma proteína transportadora (cl3316) foi identificada in silico como exclusiva das cepas subclínicas. Diferentes programas de predição foram utilizados para a identificação das proteínas de superfície e secretadas das seis cepas, as quais foram usadas na construção de um plot de escala multidimensional (MDS). Os resultados mostraram alta similaridade entre as proteínas das cepas estudadas. Pela inspeção visual, identificaram-se dois grupos de ortólogos, cl3309 e cl3700, correspondentes a uma proteína hipotética e a uma lipoproteína, respectivamente, que possuem regiões de maior similaridade entre as clínicas ou subclínicas. Os dados encontrados in silico foram validados pela reação em cadeia da polimerase em isolados bacterianos coletados em fazendas leiteiras. Todos os isolados subclínicos foram corretamente identificados com os primers desenhados para as cepas subclínicas, porém existe a necessidade de redesenhar novos primers para a correta discriminação dos isolados clínicos.Item Aprimoramento do diagnóstico de Leishmaniose visceral canina por ELISA usando o antígeno NTPDase-2 de Leishmania (Leishmania) infantum chagasi e padronização do diagnóstico por imunocromatografia(Universidade Federal de Viçosa, 2016-02-23) Souza, Anna Cláudia Alves de; Fietto, Juliana Lopes Rangel; http://lattes.cnpq.br/5714686709236004A leishmaniose visceral canina (LVC), causada pela Leishmania infantum chagasi é foco de diversos estudos, devido à relevância do cão como reservatório. No Brasil, a eutanásia de cães infectados é usada como controle da doença, orientada pelas técnicas de RIFI e ELISA. Porém estas técnicas apresentam limitações, que justificam o aprimoramento do diagnóstico. Em um trabalho prévio do nosso grupo, a proteína recombinante NTPDase-2 de L. infantum chagasi foi usada como antígeno em ensaios de ELISA, mostrando bom potencial para esta aplicação. O objetivo deste trabalho foi aprimorar o diagnóstico por ELISA. Para isto, foi feita a purificação manual e automatizada (FPLC). As purificações manuais forneceram maior grau de pureza e o processo em FPLC forneceu maior rendimento. Assim, várias purificações foram testadas, a fim de obter alto grau de pureza em sistema automatizado. Novos ELISAs foram realizados usando diferentes quantidades de antígeno (0,1 – 0,5 µg), diferentes diluições do soro de cães positivos e negativos (1:40; 1:80 e 1:160) e diferentes substratos de desenvolvimento de cor (TMB e OPD) para revelação. A influência da conformação do antígeno foi avaliada usando-o em condição nativa ou desnaturada. Na padronização do ELISA, 0,1 µg de antígeno e diluição do soro 1:160 foram as melhores condições. O uso de TMB e OPD não geraram diferenças significativas. Além disto, o antígeno renaturado também não levou à diferença significativa, indicando que o reconhecimento antígeno x anticorpo independente da conformação do antígeno. Quanto às purificações em FPLC, a melhor foi obtida usando 0,5 pellet bacteriano referente a 400 mL de indução, que forneceu grau de pureza de 96,6%. Além disso, foram feitos testes preliminares para a padronização deste antígeno em testes imunocromatográfcos. Foram padronizadas as conjugações da Proteína A e anti-IgG de cão a ouro coloidal de 40 nm. Para a linha controle, foi padronizada a concentração 2,5 µg/µL de IgG de cão na membrana de nitrocelulose e diluição do conjugado de 5x. Nossos dados confirmam que a NTPDase-2 tem potencial para o diagnóstico da LVC e que é possível melhorar os níveis de detecção de anticorpos variando as condições do ensaio. Além disto, foi possível iniciar a padronização de um teste imunocromatográfico que poderá futuramente trazer nova alternativa para o diagnóstico da LVC.