Ciências Biológicas e da Saúde
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Item Avaliação da expressão dos genes que codificam a proteína RAS e o fator de elongação EF1α em ectomicorrizas de Scleroderma laeve e Eucalyptus grandis(Universidade Federal de Viçosa, 2011-07-18) Pereira, Maíra de Freitas; Queiroz, Marisa Vieira de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4785812Z5; Costa, Maurício Dutra; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4728228J5; Araujo, Elza Fernandes de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783675E2; http://lattes.cnpq.br/2561089682655555; Bazzolli, Denise Mara Soares; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4761710D6; Pereira, Olinto Liparini; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4767879D4A associação ectomicorrízica é uma interação mutualista entre raízes de plantas e fungos do solo, resultando em mudanças morfofisiológicas do sistema radicular das plantas. Os benefícios nutricionais advêm da capacidade do fungo em aumentar a absorção de nutrientes minerais pelas plantas, recebendo em troca os fotoassimilados. Na associação entre Scleroderma laeve e Eucalyptus grandis ainda não se tem informações de quais genes são decisivos e estão relacionados a este processo. Transcritos dos genes ras e ef1α foram identificados durante a formação da simbiose e sendo diferencialmente expressos na associação ectomicorrízica, e estão relacionados a vias de transdução de sinal e atuando na síntese protéica, respectivamente. Assim, os objetivos deste trabalho foram estabelecer a associação ectomicorrízica in vitro entre S. laeve e E. grandis, isolar sequências parciais dos genes ras e ef1α do fungo ectomicorrízico S. laeve, e avaliar a expressão funcional destes genes durante as fases de formação das ectomicorrizas. Este trabalho comprova a associação in vitro entre S. laeve e E. grandis, sendo registrada pela primeira vez. As estruturas típicas das ectomicorrizas, como a formação do manto fúngico e da rede de Hartig foram observadas. Nos tempos avaliados, em três dias de contato já havia a formação do manto fúngico. Aos 15 dias, o manto fúngico estava completamente formado, as células da epiderme alongadas e a rede de Hartig, em formação. Aos 30 dias, as ectomicorrizas apresentavam todas as estruturas típicas desenvolvidas. Para avaliar a expressão dos genes durante a associação, sequências parciais dos genes ras e ef1α foram isolados, e os transcritos destes genes foram avaliados na fase pré-simbiótica e aos três, 15 e 30 dias após o contato físico. Os transcritos do gene ef1α foram expressos durante todos os tempos avaliados. Os transcritos do gene ras foram detectados nas ectomicorrizas após três, 15 e 30 dias. Estes resultados são fundamentais para uma melhor compreensão da associação ectomicorrízica entre S. laeve e E. grandis e sugerem que as vias de transdução de sinais mediada por ras podem ser funcionais durante o estabelecimento da simbiose entre os fungos e as raízes de plantas.Item Expressão gênica em ovócitos suínos de diferentes classificações morfológicas(Universidade Federal de Viçosa, 2012-12-20) Oliveira, Flávia Aline Silveira Alvim Mendes de; Costa, Eduardo Paulino da; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4787237D6; Guimarães, José Domingos; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4782270U6; http://lattes.cnpq.br/3657670993938722; Guimarães, Simone Eliza Facioni; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4782526Y2A produção in vitro de embriões suínos ainda tem tidos resultados insatisfatórios devido a baixa de produção de blastocisto, a porcentagem de embriões produzidos de ovócitos maturados in vitro é inferior àqueles maturados in vivo. Diversos fatores interferem no sucesso da maturação, entretanto, a competência ovocitária é um dos fatores mais importantes. Somente ovócitos competentes são capazes de sofrer a fecundação e ter desenvolvimento embrionário normal. A competência ovocitária pode ser avaliada a partir de vários parâmetros, tais como morfologia do ovócito, tamanho do folículo, coloração com brilliant cresyl blue (BCB), momento da clivagem e idade da doadora. Nos últimos anos esses parâmetros têm sido utilizados para os estudos da expressão dos genes associados com a competência. Este trabalho teve por objetivo avaliar diferenças na expressão dos genes BMP15, RYBP, MATER, ZAR1 e como controle endógeno o gene constitutivo GAPDH em ovócitos imaturos de diferentes classes morfológicas sendo elas: 1, 2, 3 e 4. Como finalidade elucidar os mecanismos necessários para que o ovócito adquira competência e proporcionar importantes marcadores moleculares relacionados com a capacidade de desenvolvimento. O RNA total ovócitos foi extraído e utilizado como molde para a síntese da primeira fita de cDNA. Os resultados da expressão gênica foram analisados utilizando um modelo misto, considerando os dados de expressão gênica variável dependente e as classes ovocitárias variáveis independentes. Os genes BMP15, ZAR1 e RYBP apresentaram expressão semelhante nas classes ovocitárias 1, 2 e 3, somente a categoria 4 diferiu na expressão desses genes (P<0,05). O gene MATER foi expresso de forma semelhante em todas as classes ovocitárias estudadas (P>0,05). A técnica de qPCR, no presente trabalho, foi eficiente para detecção destes transcritos em ovócitos de diferentes classes. No entanto, para melhor entendimento do envolvimento desses transcritos na aquisição da competência ovocitária são necessários mais estudos avaliando ovócitos de diferentes classes morfológicas, em diferentes fases de desenvolvimento e implicação de outros genes envolvidos com a competência ovocitária.Item Expressão de genes de Staphylococcus aureus em resposta a concentrações subinibitórias de antibióticos utilizados no tratamento da mastite bovina(Universidade Federal de Viçosa, 2012-07-23) Aguilar, Ananda Pereira; Bazzolli, Denise Mara Soares; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4761710D6; Zerbini, Poliane Alfenas; http://lattes.cnpq.br/8632328159533071; Ribon, Andréa de Oliveira Barros; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4727026E6; http://lattes.cnpq.br/8173710952837463; Fietto, Luciano Gomes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4763824H8; Ramos, Juliana Rocha Lopes Soares; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4790613J3; Moreira, Maria Aparecida Scatamburlo; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4797678J6Staphylococcus aureus é um dos principais patógenos associado à mastite bovina. Essa bactéria produz vários fatores de virulência que conferem a capacidade de adesão e disseminação pelo tecido mamário, sendo esses fatores regulados por um conjunto de diversas proteínas. Durante a antibioticoterapia essas bactérias podem ser expostas a concentrações subinibitórias de antibiótico (subCIM) que podem alterar a expressão de diversos genes. Assim, o objetivo desse trabalho foi analisar o efeito de concentrações subinibitórias de gentamicina e penicilina, comumente utilizados no tratamento da mastite contagiosa bovina, na expressão tanto dos genes reguladores como dos genes de virulência de dois isolados de S. aureus geneticamente distintos. Inicialmente determinou-se a concentração inibitória mínina dos antibióticos, que apresentou valores próximos para os dois isolados e, posteriormente foram realizadas curvas de crescimento para selecionar as concentrações que não eram capazes de afetar drasticamente a taxa de crescimento. Culturas bacterianas submetidas a 0,25x, 0,12x e 0,06xCIM dos antibióticos penicilina e gentamicina foram cultivadas até metade da fase exponencial e início da fase estacionária (pós-exponencial) e utilizadas para extração de RNA. Em seguida, analisou-se a expressão dos genes sdrC, clfB, hla, hlb, icaD, agrA, saeR, sarA e rot pela técnica de PCR em tempo real. Os dados de expressão foram analisados pelo método de Livak (2001) e normalizadas pelo gene endógeno gyrB. Os isolados 3993 e 3212 responderam de maneira diferenciada à expressão dos genes quando submetidos a concentrações subinibitórias, o que dificulta a generalização do efeito dos antibióticos. SubCIM foram capazes de alterar a expressão de alguns genes regulatórios e genes de virulência. As concentrações de 0,25x e 0,12xCIM de gentamicina foram capazes de aumentar a expressão dos genes reguladores sarA e rot, para as culturas da bactéria 3993 obtidas na fase pós-exponencial. As concentrações de 0,12x e 0,06xCIM de penicilina foram capazes de alterar a expressão de hla em ambas as fases de crescimento, enquanto 0,25xCIM de gentamicina aumentou a expressão de hla na fase exponencial e hlb na fase pós-exponencial. Entretanto, ambos os antibióticos não foram capazes de alterar a expressão dos genes sdrC, clfB, icaD, agrA e saeR para essa mesma bactéria. Para o isolado 3212, 0,25xCIM de penicilina modulou significativamente o gene clfB quando a cultura foi obtida na fase exponencial. Assim, os resultados demonstraram que os antibióticos estudados podem induzir o aumento da expressão dos fatores de virulência, podendo conduzir a um efeito não desejável: a progressão da infecção.Item Effect of postharvest jasmonic acid treatment on storage diseases, biochemical and molecular analyses of induced disease resistance in sugarbeet (Beta vulgaris L.)(Universidade Federal de Viçosa, 2012-03-16) Ferrareze, Jocleita Peruzzo; Finger, Fernando Luiz; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783681Y0; http://lattes.cnpq.br/8425953721837930; Fugate, Karen Klotz; Chaves, Daniela Vieira; http://lattes.cnpq.br/9547020959512231; Barros, Raimundo Santos; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4787859T6; Deckard, EdwardÁcido jasmônico (AJ) e seus derivativos são conhecidos por ativar os mecanismos de defesa das plantas e fornecer proteção contra fungos causadores de podridões em várias espécies de vegetais. No presente trabalho testou-se a eficiência do ácido jasmônico em proteger raízes de beterraba-açucareira (Beta vulgaris L.) contra os três principais patógenos causadores de podridões pós-colheita. AJ reduziu a podridão causada por Botrytis cinerea e Phoma betae em uma média de 51 e 71% respectivamente e em concentrações de 0.01 10 μM AJ reduziu podridão causada por Penicillium claviforme em uma média de 44%, enquanto 100 μM reduziu a podridão em 65%. Tendo-se em vista os resultados mostrando a habilidade do AJ em proteger raízes de beterraba-açucareira contra os patógenos citados, os mecanismos responsáveis pela indução da resistência por jasmonatos foram estudados. A atividade de enzimas com função antioxidante como ascorbato peroxidase (APX), catalase (CAT), peroxidase (POD) e superóxido dismutase (SOD), e metabólitos com propriedades antioxidantes foram analisados. A atividade de enzimas relacionadas com a defesa de plantas como β-1,3-glucanase (β-Gluc), quitinase, polifenol oxidase (PPO) e fenilalanina amônia-liase (PAL) também foram estudadas. Constatou-se que o AJ teve pouca ou nenhuma ação sobre a atividade dessas enzimas ou compostos, levando-nos a acreditar que essas enzimas não tem relação com a resistência induzida por jasmonatos em raízes de beterraba-açucareira. Com exceção da PAL todas as enzimas foram afetadas pelo tempo de armazenamento sendo que a maioria teve sua atividade aumentada com o decorrer do armazenamento. Tendo em vista que as defesas das raízes ficam reduzidas com o passar do tempo infere-se que essas enzimas não estejam relacionadas com defesa contra patógenos e doenças em beterraba-açucareira. O efeito do AJ também foi testado em nível de expressão gênica. Utilizando-se a técnica de PCR em tempo real, verificou-se que o AJ teve efeito pequeno e transiente na expressão de genes relacionados à defesa de plantas. A expressão da fenilalanina amônia-liase (PAL) e peroxidase (POD) foram transientemente induzidas por acido jasmônico. Em contraste, PR1 e quitinase 1 foram transientemente inibidas pelo tratamento e quitinase 3 exibiu uma redução e um aumento nos níveis de transcritos. O transcriptoma global de beterraba açucareira foi caracterizado usando-se a plataforma Illumina paired-end sequencing. Grande quantidade de dados inéditos foram gerados. Os efeitos do AJ no transcriptoma das raízes também foi estudado revelando que 120 e 104 genes tiveram suas expressões alteradas aos 2 e 60 dias após o tratamento respectivamente.Item Differential Gene Expression (DGE) by RNA sequencing analysis and development of software for integrating different DGE methods(Universidade Federal de Viçosa, 2014-02-28) Brustolini, Otávio José Bernardes; Ramos, Humberto Josué de Oliveira; http://lattes.cnpq.br/4037452920080174; Fietto, Luciano Gomes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4763824H8; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781848H2; http://lattes.cnpq.br/0928279245502410; Fietto, Juliana Lopes Rangel; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4790238D0; Silva, Fabyano Fonseca e; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4766260Z2; Carvalho, Benilton de Sa; http://lattes.cnpq.br/0897291971174045Os begomovirus são geminivirus transmitidos pela mosca branca, e causam severos sintomas em cultivares com um grande impacto econômico na agricultura de regiões tropicais e subtropicais. Com as recentes mudanças climáticas é esperado uma forte alteração na distribuição da mosca branca ao redor do globo, tornando-a uma das mais sérias ameaças à agricultura. No tomateiro este fato ainda é mais preocupante, pois há uma complexa população de espécies emergentes de begomovirus que infectam estas plantas. Neste presente trabalho, nós propomos o estudo de um novo mecanismo regulatório presente em células vegetais que responde a infecção viral. Por meio da mutação no receptor imune NIK, o qual é alvo da proteína viral NSP, nós promovemos a ativação de um mecanismo de resposta antiviral que confere uma tolerância eficaz a diferentes espécies de begomovirus. Os nossos resultados também melhoraram o entendimento sobre o mecanismo de defesa intermediada pelo receptor NIK. Por meio de uma comparação usando quatro técnicas de agrupamentos hierárquico com quatro diferentes normalizadores presente no pacote edgeR, os perfis transcricionais do mutante T474D, que é o receptor NIK na sua forma ativa, com os das plantas infectas, mostraram que as plantas T474D mimetizaram o perfil das plantas infectadas, pois estes dois grupos se agruparam com um alto grau de confiabilidade, enquanto as plantas NIK induzidas e selvagens se diferenciaram em um grupo a parte. Além disso, a eliminação dos genes diferencialmente expressos (DE) do mutante T474D em todos os dados brutos dos tratamentos reforçaram que a resposta do mutante T474D mimetiza a planta com a infecção viral, pois os genótipos das plantas infectadas se agruparam com as selvagens também com um alto grau de confiabilidade. Portanto, estes resultados indicam que a infecção viral induziu a resposta antiviral mediada por NIK. Também foi empregado quatro diferentes métodos de expressão diferencial e um método ivde enriquecimento de grupos gênicos (GSEA) nos dados de RNA-seq. Estes revelaram que a expressão ectópica do mutante T474D causa uma massiva down regulação de genes relacionados a tradução e uma up regulação de genes associados ao sistema imune. A down regulação mediada por T474D dos genes relacionados a tradução foi associado a uma supressão global na produção de proteínas, diminuindo assim a tradução dos polissomos do mRNA viral, aumentando, então a tolerância a begomovirus. Coletivamente nossos dados indicam que a sinalização antiviral mediada por NIK promove a resposta de defesa pela (i) supressão global da tradução e (ii) up regulação dos genes relacionado ao sistema imune da planta. O grande volume de dados provenientes do sequenciamento de RNA (RNA-seq) por meio de técnicas que geram uma grande quantidade de dados tal como os vindos de tecnologias de sequenciadores de nova geração, já estão disponíveis para a maioria dos laboratórios de pesquisa, e portanto está rapidamente se tornando uma ferramenta chave nos experimentos de expressão gênica. Os dados de RNA- seq são trabalhados da seguinte forma: os fragmentos (pequenas sequencias geradas pela tecnologia atual de RNA-seq) são mapeadas (alinhadas) com sequencias de referencia que podem ser o genoma ou transcriptoma, então uma tabela de contagemcontendo o número de fragmentos por gene é gerada e posteriormente analisada com os métodos de expressão diferencial. Na verdade este protocolo pode ser um trabalho árduo para pessoas que não têm muita experiência no ambiente R. Para encontrar genes cuja a expressão estão estatisticamente diferentes entre os tratamentos, além de avaliar o significado biológico através da anotação, muitos scripts do R precisam ser criados e as análises serem rodadas de forma correta. A variedade de opções contidas nas metodologias para a expressão gênica diferencial do ambiente R/Bioconductor fazem a tarefa de analisar esses tipos de dados ainda mais complicada. Portanto, nós desenvolvemos uma plataforma que facilita esse tipo de análise, fazendo com que as interações entre o usuário e o ambiente seja rápida e amigável. Ainda este sistema permite a possibilidade de combinar diferentes p- valores usando técnicas inspiradas na meta análise. Os métodos de expressão diferencial disponíveis são: edgeR, DESeq2, baySeq e NBPSeq. De fato, por meio de poucos passos uma análise poderá ser completada. Um diretório contendo o projeto que são informações das análises e todos os arquivos gerados incluindo os scripts serão armazenados juntamente com um banco de vdados em SQLite contendo os genes diferencialmente expressos com seu valor de expressão e anotação. Este programa é livre e de código aberto, permitindo assim quaisquer contribuições. Está plataforma é completamente livre.Item Indutores de resistência e silício na interação Glycine max L. (Merrill)-Phakopsora pachyrhizi(Universidade Federal de Viçosa, 2012-02-03) Cruz, Maria Fernanda Antunes da; Rodrigues, Fabrício de ávila; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4709080E6; Moreira, Maurílio Alves; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4796105P2; Barros, Everaldo Gonçalves de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781285J6; http://lattes.cnpq.br/5683901072996340; Caixeta, Eveline Teixeira; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4728636Z7; Furtado, Gleiber Quintão; http://lattes.cnpq.br/1676492508949464; Araújo, João Marcos de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4794558T1; Piovesan, Newton Deniz; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4728400U5Este trabalho foi redigido na forma de artigos científicos, os quais já foram ou serão submetidos para publicação em periódicos nacionais e internacionais. Os artigos foram escritos em português e inglês e formatados de acordo com as exigências dos periódicos para os quais foram ou serão enviados, em congruência com as Normas de redação de Teses e Dissertações da UFV. Os resumos dos artigos contendo seus objetivos e resultados são apresentados a seguir: 1) Acibenzolar-S-metil, ácido jasmônico e silício na resistência da soja à ferrugem asiática- o objetivo deste estudo foi avaliar alguns componentes de resistência em soja supridas com silicato de cálcio (SC) em solo, ou pulverizadas com acibenzolar-S-metil (ASM), ácido jasmônico (AJ) e silicato de potássio (SP), e água desionizada (controle), e inoculadas com Phakopsora pachyrhizi. O período de incubação foi maior nas plantas dos tratamentos ASM e SC que diferiram estatisticamente das plantas do tratamento controle. Para o período latente apenas as plantas do tratamento ASM diferiram do controle. O menor número de uredinias/cm² foi verificado nas plantas do tratamento SP. As plantas pulverizadas com SP e ASM apresentaram menor severidade da ferrugem diferindo das plantas do tratamento controle. Para a área abaixo da curva do progresso da ferrugem apenas as plantas pulverizadas com SP diferiram significativamente das plantas do tratamento controle. ASM e SP foram os produtos mais eficientes para a redução dos sintomas da ferrugem asiática da soja (FAS). 2) Silício no processo infeccioso de Phakopsora pachyrhizi em folíolos de plantas de soja- o objetivo deste trabalho foi investigar por meio de observações em lupa e microscopia de luz e eletrônica de varredura o efeito do ácido monossilício (Si) no processo infeccioso de P. pachyrhizi em folíolos de soja cultivada em solução nutritiva contendo ou não Si. Nos folíolos das plantas supridas com Si, as uredinias foram menores e em menor número, houve redução de 27, 23 e 60% no número de lesões, uredinias fechadas e uredinias abertas, respectivamente. 3) Expressão gênica da interação soja-P. pachyrhizi em resposta a acibenzolar-S-metil, ácido jasmônico e silício em solo e em solução nutritiva- o objetivo deste estudo foi verificar o efeito da aplicação de ASM, AJ e SC em solo e ácido monossilícico (Si) em solução nutritiva na expressão de seis genes de defesa (fenilalanina amônio liase - FAL, quitinase - QUI, chalcona isomerase - CHAL, lipoxigenase - LOX, proteína relacionada a resistência - PR1, metaloproteinase - MET) na interação soja-P. pachyrhizi às 12, 72 e 141 horas após a inoculação (hai). Os genes de defesa foram mais expressos às 141 hai. No experimento em solo houve maior expressão dos genes FAL e CHAL nas plantas inoculadas e pulverizadas com ASM às 141 hai. As plantas supridas com SC e inoculadas apresentaram menor expressão do gene marcador do patógeno. Houve redução da severidade nas plantas dos tratamentos ASM e SC quando comparadas às plantas controle. No experimento em hidroponia às 141 hai houve menor expressão dos genes MET, LOX, PR1, QUI e CHAL nas plantas supridas com Si e inoculadas, quando comparadas às plantas não supridas com Si e inoculadas. O suprimento de Si em solução nutritiva resultou na redução de 60% da severidade da doença. 4) Indutores de resistência e silício sobre a atividade de enzimas de defesa na interação soja- P. pachyrhizi- o objetivo deste artigo foi determinar a influência dos indutores de resistência AJ, ASM e SC sobre a atividade das enzimas QUI, glicanase (GLI), peroxidase (POX), polifenoloxidase (PPO) e FAL no patossitema soja- P. pachyrhizi às 24, 48, 72 e 141 hai. Houve a potencialização da atividade da enzima QUI nas plantas supridas com SC às 141 hai, e das enzimas GLI e FAL às 72 e 141 hai. Não houve potencialização da atividade das enzimas POX e PPO.