Differential Gene Expression (DGE) by RNA sequencing analysis and development of software for integrating different DGE methods

Abstract

Os begomovirus são geminivirus transmitidos pela mosca branca, e causam severos sintomas em cultivares com um grande impacto econômico na agricultura de regiões tropicais e subtropicais. Com as recentes mudanças climáticas é esperado uma forte alteração na distribuição da mosca branca ao redor do globo, tornando-a uma das mais sérias ameaças à agricultura. No tomateiro este fato ainda é mais preocupante, pois há uma complexa população de espécies emergentes de begomovirus que infectam estas plantas. Neste presente trabalho, nós propomos o estudo de um novo mecanismo regulatório presente em células vegetais que responde a infecção viral. Por meio da mutação no receptor imune NIK, o qual é alvo da proteína viral NSP, nós promovemos a ativação de um mecanismo de resposta antiviral que confere uma tolerância eficaz a diferentes espécies de begomovirus. Os nossos resultados também melhoraram o entendimento sobre o mecanismo de defesa intermediada pelo receptor NIK. Por meio de uma comparação usando quatro técnicas de agrupamentos hierárquico com quatro diferentes normalizadores presente no pacote edgeR, os perfis transcricionais do mutante T474D, que é o receptor NIK na sua forma ativa, com os das plantas infectas, mostraram que as plantas T474D mimetizaram o perfil das plantas infectadas, pois estes dois grupos se agruparam com um alto grau de confiabilidade, enquanto as plantas NIK induzidas e selvagens se diferenciaram em um grupo a parte. Além disso, a eliminação dos genes diferencialmente expressos (DE) do mutante T474D em todos os dados brutos dos tratamentos reforçaram que a resposta do mutante T474D mimetiza a planta com a infecção viral, pois os genótipos das plantas infectadas se agruparam com as selvagens também com um alto grau de confiabilidade. Portanto, estes resultados indicam que a infecção viral induziu a resposta antiviral mediada por NIK. Também foi empregado quatro diferentes métodos de expressão diferencial e um método ivde enriquecimento de grupos gênicos (GSEA) nos dados de RNA-seq. Estes revelaram que a expressão ectópica do mutante T474D causa uma massiva down regulação de genes relacionados a tradução e uma up regulação de genes associados ao sistema imune. A down regulação mediada por T474D dos genes relacionados a tradução foi associado a uma supressão global na produção de proteínas, diminuindo assim a tradução dos polissomos do mRNA viral, aumentando, então a tolerância a begomovirus. Coletivamente nossos dados indicam que a sinalização antiviral mediada por NIK promove a resposta de defesa pela (i) supressão global da tradução e (ii) up regulação dos genes relacionado ao sistema imune da planta. O grande volume de dados provenientes do sequenciamento de RNA (RNA-seq) por meio de técnicas que geram uma grande quantidade de dados tal como os vindos de tecnologias de sequenciadores de nova geração, já estão disponíveis para a maioria dos laboratórios de pesquisa, e portanto está rapidamente se tornando uma ferramenta chave nos experimentos de expressão gênica. Os dados de RNA- seq são trabalhados da seguinte forma: os fragmentos (pequenas sequencias geradas pela tecnologia atual de RNA-seq) são mapeadas (alinhadas) com sequencias de referencia que podem ser o genoma ou transcriptoma, então uma tabela de contagemcontendo o número de fragmentos por gene é gerada e posteriormente analisada com os métodos de expressão diferencial. Na verdade este protocolo pode ser um trabalho árduo para pessoas que não têm muita experiência no ambiente R. Para encontrar genes cuja a expressão estão estatisticamente diferentes entre os tratamentos, além de avaliar o significado biológico através da anotação, muitos scripts do R precisam ser criados e as análises serem rodadas de forma correta. A variedade de opções contidas nas metodologias para a expressão gênica diferencial do ambiente R/Bioconductor fazem a tarefa de analisar esses tipos de dados ainda mais complicada. Portanto, nós desenvolvemos uma plataforma que facilita esse tipo de análise, fazendo com que as interações entre o usuário e o ambiente seja rápida e amigável. Ainda este sistema permite a possibilidade de combinar diferentes p- valores usando técnicas inspiradas na meta análise. Os métodos de expressão diferencial disponíveis são: edgeR, DESeq2, baySeq e NBPSeq. De fato, por meio de poucos passos uma análise poderá ser completada. Um diretório contendo o projeto que são informações das análises e todos os arquivos gerados incluindo os scripts serão armazenados juntamente com um banco de vdados em SQLite contendo os genes diferencialmente expressos com seu valor de expressão e anotação. Este programa é livre e de código aberto, permitindo assim quaisquer contribuições. Está plataforma é completamente livre.