Ciências Biológicas e da Saúde
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Item Predição in silico de Proteínas Extracelulares de Kluyveromyces lactis e suas relações com fatores transcricionais(Universidade Federal de Viçosa, 2008-07-31) Brustolini, Otávio José Bernardes; Fietto, Luciano Gomes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4763824H8; Cruz, Cosme Damião; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4788274A6; Passos, Flávia Maria Lopes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781817D3; http://lattes.cnpq.br/0928279245502410; Mantovani, Hilário Cuquetto; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4727026Z7; Yotoko, Karla Suemy Clemente; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4763141P7O banco de dados da Kluyveromyces lactis constituído de 5327 seqüências de proteínas (http://cbi.labri.fr/Genolevures) foi submetido a quatro algoritmos de predição para identificar o potencial secretome extracelular. O primeiro,SignalP v3 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0), que identifica a presença de peptideo sinal na porção N-terminal e o sítio de clivagem da peptidase sinalagrupou 698 proteínas.Deste grupo, o Phobius(http://phobius.sbc.su.se), que prevê a topologia de domínios transmembranas a partir das sequencias primárias, indicou 260 sem domínios transmembranas.Outros dois algoritmos, big-PI predictor(http://mendel.imp.ac.at/gpi/gpi_server.html),capaz reconhecer marcas de de ancoras GPI (Glicosilfosfatidilinositol) e WoLF PSORT(http://www.genscript.com/psort/wolf_psort.html)capaz de identificar assinaturas para a localização em compartimentos subcelulares apontaram 236 proteínas sem ancoras GPI e 101 endereçadas ao meio extracelular. Como controle positivo, os mesmos algoritmos foram testados e predisseram corretamente 95 proteínas de leveduras Saccharomycetes encontradas nos bancos de dados públicos (NCBI e UNIProt) e anotadas como extracelulares. Como controle negativo foram preditas como intracelular 95 seqüências aleatórias do banco de dados da K. lactis. O grupo controle positivo e o grupo predito foram comparados pelo teste estatístico T2 de Hotelling. Não foram evidenciadas diferenças significativas entre os valores das médias dos grupos.A condição fisiológicana qual estas proteínas extracelulares são expressas foi analisada relacionando suas seqüências promotoras com os fatores transcricionais ortólogos da Saccharomyces cerevisiae. A metodologia aplicada foi o "Yeastract" (http://www.yeastract.com) que localiza sítios de ligação ao DNA dos fatores transcricionais de S. cerevisiaenas seqüências promotoras dos ORFs das proteínas preditas como extracelulares. A condição fisiológica que favorece a expressão para o meio extracelular foi obtida pela pesquisa dos termos descritos pelo "Gene Ontology"(http://www.geneontology.org). Os fatores transcricionais que mais se relacionam com as seqüências preditas foram aqueles associados com resposta a estresse. Também foi indicado que o estresse ácido e limitação de nitrogênio (aminoácidos) exercem influência na expressão das proteínas extracelulares.Item Utilização de Kluyveromyces lactis na expressão da GDPase de Leishmania major.(Universidade Federal de Viçosa, 2009-08-21) Santos, Yaro Luciolo dos; Fietto, Juliana Lopes Rangel; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4790238D0; Queiroz, Marisa Vieira de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4785812Z5; Passos, Flávia Maria Lopes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781817D3; http://lattes.cnpq.br/6294868436822899; Fietto, Luciano Gomes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4763824H8; Paula, Sérgio Oliveira de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4767540P4A levedura Kluyveromyces lactis apresenta potencial aplicabilidade biotecnológica como hospedeira na produção heteróloga de proteínas recombinantes de interesse biotecnológico. Neste contexto o objetivo deste trabalho foi expressar a proteína GDPase de Leishmania major em K. lactis para fins biotecnológicos aplicados às leishmanioses humana e canina. A GDPase de L. major pertence à família das E-NTPDases ou apirases, proteínas envolvidas na infectividade e virulência de parasitos. A técnica da Reação da Polimerase em Cadeia (PCR) foi utilizada para amplificar uma seqüência de 2073 pb referente a região codificante completa da GDPase de L. major, sendo este amplicon inserido no plasmídeo pKLAC1 nos sítios Sal I e Bgl II. A construção pKLAC1-GDPase foi confirmada por PCR, linearizada pela enzima Ahd I e utilizada para transformação da cepa selvagem de K. lactis CBS 2359. Os transformantes foram selecionados em meio YCB contendo 5 mM de acetamida e cultivados sob condições de indução em batelada em meio YPGal. Extrato e sobrenadante destas culturas foram analisados por SDS-PAGE e Western Blot utilizando um anti-soro policlonal anti-GDPase de L. major. As análises revelaram uma única proteína de cerca de 120 kDa nas cepas selvagem e transformantes de K. lactis. Pesquisa no Genbank revelou a presença de dois genes homólogos a GDPase no genoma da levedura: KlGDA1 e KlYND1que podem explicar a reatividade cruzada. Os resultados demonstram que os transformantes obtidos não produzem a GDPase de L. major, provavelmente devido a não reconstituição do promotor PLAC4 que dirigiria a expressão do gene da GDPase. Porém levanta as hipóteses de que a cepa selvagem possa ser testada quanto à indução da produção de anticorpos contra espécies do gênero Leishmania e de sinalizar que o sistema utilizado contém falhas que comprometem seu uso, devido à dependência de reconstituição do promotor PLAC4.Item Influência de KlRox1p no metabolismo fermentativo de Kluyveromyces lactis(Universidade Federal de Viçosa, 2009-02-16) Harami, Talita; Fietto, Luciano Gomes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4763824H8; Mantovani, Hilário Cuquetto; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4727026Z7; Passos, Flávia Maria Lopes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781817D3; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4750606T5; Bazzolli, Denise Mara Soares; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4761710D6; Vanetti, Maria Cristina Dantas; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783874H3; Ramos, Juliana Rocha Lopes Soares; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4790613J3Esse trabalho é uma contribuição aos estudos sobre a função de KlRox1p no metabolismo fermentativo de Kluyveromyces lactis. Rox1p é conhecida em Saccharomyces cerevisiae por reprimir, em aerobiose, genes que são expressos em condição limitante de oxigênio. A cinética de crescimento de linhagens de Kluyveromyces lactis MW270-7B e sua mutante derivativa K. lactis MW270-7B rox1Δ foi realizada em meio YNB (Yeast Nitrogen Base) contendo fontes de carbono fermentáveis (glicose e lactose) ou não fermentáveis (glicerol e etanol) para determinar o perfil de crescimento nessas fontes. Além disso, ambas as linhagens tiveram sua capacidade fermentativa avaliada na presença de um inibidor da cadeia transportadora de elétrons, antimicina A, em meio YPD (extrato de levedura, peptona e glicose). Os resultados indicaram que a ausência de KlROX1 não favoreceu o crescimento em fontes de carbono fermentáveis, mas favoreceu em fontes de carbono não fermentáveis. A maior capacidade fermentativa de K. lactis rox1Δ foi confirmada pelo maior rendimento de etanol por biomassa detectada, na ausência e presença de antimicina A (10 e 20 µM). As linhagens mutante rox1 e controle também foram cultivadas em YNB e glicose em regime contínuo (D= 0,1h-1) sob aerobiose e, em seguida, submetidas à hipoxia por 9 horas. Amostras foram coletadas a cada 3 horas para análise da expressão de possíveis genes alvos de KlRox1p, bem como de etanol e da atividade da álcool desidrogenase (ADH). Para análise da expressão gênica, sequências de reconhecimento por KlRox1p foram pesquisadas in silico nos promotores dos genes KlAAC3, KlCOX5B, KlHEM13, KlHAP1, KlRAG1 e KlADH1 e foram encontradas divergindo de dois nucleotídeos da sequência consenso YYYATTGTTCTC. KlRox1p mostrou ter efeito negativo sobre as expressões de KlAAC3 e KlHEM13 em aerobiose, mas não pareceu atuar sobre KlCOX5B. A concentração de etanol, a atividade da ADH e a expressão de KlADH1 evidenciaram o metabolismo mais fermentativo de K. lactis rox1Δ tanto em aerobiose quanto em hipoxia. E, por um mecanismo ainda desconhecido, KlRox1p atuou sobre as expressões de KlHAP1 e KlRAG1. A influência de KlRox1p na expressão de KlADH1, KlRAG1 e KlHAP1, sugere a participação de KlRox1p no controle de pontos chaves do metabolismo fermentativo: entrada da glicose, que determina o fluxo para a manutenção de uma via fermentativa, bem como na reação redutiva final, que culmina com a formação de etanol. A existência de genes que mostraram ser regulados negativamente por KlRox1p em aerobiose, como KlAAC3 e KlHEM13, indica a existência em K. lactis de mecanismo de regulação transcricional por oxigênio que visa melhor utilizar o oxigênio numa condição limitante, semelhante à função de Rox1p em Saccharomyces cerevisiae. Esse mecanismo, entretanto, parece não estar relacionado apenas com as concentrações de oxigênio, mas também com metabolismo de carbono fermentável ou não fermentável.Item Proteoma extracelular de Kluyveromyces lactis em cultura contínua sob limitação de nitrogênio(Universidade Federal de Viçosa, 2008-03-13) Santos, Agenor Valadares; Santoro, Marcelo Matos; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/index.jsp; Mantovani, Hilário Cuquetto; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4727026Z7; Passos, Flávia Maria Lopes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781817D3; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4704067Y1; Santos, Vera Lúcia dos; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4709316J2; Santos, Miriam Teresinha dos; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4786872Z0A identificação de proteínas extracelulares de leveduras em cultura contínua pode oferecer informações sobre a influência do status nutricional na via de captura de nutrientes alternativos. Essa análise auxilia a otimização das condições necessárias para a produção dessas proteínas com o máximo rendimento, além de oferecer uma estratégia de construção de um sistema de expressão e secreção de proteínas em leveduras. Neste trabalho, mostra-se o perfil das proteínas extracelulares de culturas de Kluyveromyces lactis submetidas a estresse por nitrogênio. A técnica de cultivo em regime contínuo, aliada à análise proteômica, foi utilizada para investigar a resposta da cultura de K. lactis em duas velocidades de crescimento estabelecidas em função da concentração de nitrogênio, ou seja, 0,03 h-1 e 0,09 h-1. A velocidade de crescimento de 0,09 h-1 mostrou o maior rendimento na produção de proteínas extracelulares (1,54 mg.L-1), maior conversão de glicose em proteína (3,3 x 10-4 g.g-1) e um maior rendimento de biomassa (0,13 g.g-1). Através da análise dos perfis protéicos em SDS-PAGE gradiente de amostras dos extratos extracelulares nas duas velocidades de crescimento, pôde-se distinguir, inicialmente, diferenças no proteoma de culturas de K. lactis. A velocidade de 0,09 h-1 apresentou maior número de bandas quando comparada com o perfil obtido para 0,03 h-1. Na identificação proteômica das bandas excisadas do gel por espectrometria de massa em MALDI-TOF-TOF-MS, os espectros obtidos foram analisados utilizando-se o software MASCOT®. As proteínas sugeridas por essa análise estão relacionadas a processos de ciclo celular, replicação, transcrição, mudanças pós-traducionais, metabolismo de carboidrato, ubiquitinação e degradação celular e são comumente encontradas no interior celular. Os extratos extracelulares de K. lactis também foram analisados por cromatografia líquida bi-dimensional (LC-2D), na qual a velocidade específica de crescimento de 0,09 h-1 apresentou maior número de picos cromatográficos, resultado que indica a presença de maior número de proteínas nessa velocidade com relação a 0,03 h-1. Nas várias análises por espectrometria de massa em MALDI-TOF-TOF-MS, das amostras advindas da cromatografia líquida 2D, obteve-se um total de 95 massas moleculares nas duas velocidades específicas de crescimento; dessas massas, aproximadamente 30% pertencem às amostras da velocidade específica de crescimento de 0,03 h-1 e 70%, à velocidade específica de crescimento de 0,09 h-1. A análise por espectrometria de massa também evidenciou a presença de glicosilações (moléculas de N-acetilglicosamina e de 8 a 15 moléculas de hexose por proteína) e de outras possíveis mudanças pós- traducionais em amostras resultantes da LC-2D de ambas as velocidades específicas de crescimento. Na identificação das proteínas extracelulares, as amostras, obtidas na LC-2D das duas velocidades específicas de crescimento, foram tripsinolizadas e analisadas novamente por espectrometria de massa, e as proteínas sugeridas pela análise foram aquelas de K. lactis ligadas ao trânsito de peptídios e ao metabolismo de carboidrato, enzimas de transcrição e outras enzimas, como transferases, cinases, hidrolases, descarboxilases, oxidases e mutarotases, do mesmo modo que na avaliação anterior; e essas proteínas não obtiveram os scores mínimos para a identificação por homologia ser considerada estaticamente significativa.