Ciências Biológicas e da Saúde
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Item Predição in silico de Proteínas Extracelulares de Kluyveromyces lactis e suas relações com fatores transcricionais(Universidade Federal de Viçosa, 2008-07-31) Brustolini, Otávio José Bernardes; Fietto, Luciano Gomes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4763824H8; Cruz, Cosme Damião; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4788274A6; Passos, Flávia Maria Lopes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781817D3; http://lattes.cnpq.br/0928279245502410; Mantovani, Hilário Cuquetto; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4727026Z7; Yotoko, Karla Suemy Clemente; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4763141P7O banco de dados da Kluyveromyces lactis constituído de 5327 seqüências de proteínas (http://cbi.labri.fr/Genolevures) foi submetido a quatro algoritmos de predição para identificar o potencial secretome extracelular. O primeiro,SignalP v3 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0), que identifica a presença de peptideo sinal na porção N-terminal e o sítio de clivagem da peptidase sinalagrupou 698 proteínas.Deste grupo, o Phobius(http://phobius.sbc.su.se), que prevê a topologia de domínios transmembranas a partir das sequencias primárias, indicou 260 sem domínios transmembranas.Outros dois algoritmos, big-PI predictor(http://mendel.imp.ac.at/gpi/gpi_server.html),capaz reconhecer marcas de de ancoras GPI (Glicosilfosfatidilinositol) e WoLF PSORT(http://www.genscript.com/psort/wolf_psort.html)capaz de identificar assinaturas para a localização em compartimentos subcelulares apontaram 236 proteínas sem ancoras GPI e 101 endereçadas ao meio extracelular. Como controle positivo, os mesmos algoritmos foram testados e predisseram corretamente 95 proteínas de leveduras Saccharomycetes encontradas nos bancos de dados públicos (NCBI e UNIProt) e anotadas como extracelulares. Como controle negativo foram preditas como intracelular 95 seqüências aleatórias do banco de dados da K. lactis. O grupo controle positivo e o grupo predito foram comparados pelo teste estatístico T2 de Hotelling. Não foram evidenciadas diferenças significativas entre os valores das médias dos grupos.A condição fisiológicana qual estas proteínas extracelulares são expressas foi analisada relacionando suas seqüências promotoras com os fatores transcricionais ortólogos da Saccharomyces cerevisiae. A metodologia aplicada foi o "Yeastract" (http://www.yeastract.com) que localiza sítios de ligação ao DNA dos fatores transcricionais de S. cerevisiaenas seqüências promotoras dos ORFs das proteínas preditas como extracelulares. A condição fisiológica que favorece a expressão para o meio extracelular foi obtida pela pesquisa dos termos descritos pelo "Gene Ontology"(http://www.geneontology.org). Os fatores transcricionais que mais se relacionam com as seqüências preditas foram aqueles associados com resposta a estresse. Também foi indicado que o estresse ácido e limitação de nitrogênio (aminoácidos) exercem influência na expressão das proteínas extracelulares.Item Proteoma extracelular de Kluyveromyces lactis em cultura contínua sob limitação de nitrogênio(Universidade Federal de Viçosa, 2008-03-13) Santos, Agenor Valadares; Santoro, Marcelo Matos; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/index.jsp; Mantovani, Hilário Cuquetto; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4727026Z7; Passos, Flávia Maria Lopes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781817D3; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4704067Y1; Santos, Vera Lúcia dos; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4709316J2; Santos, Miriam Teresinha dos; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4786872Z0A identificação de proteínas extracelulares de leveduras em cultura contínua pode oferecer informações sobre a influência do status nutricional na via de captura de nutrientes alternativos. Essa análise auxilia a otimização das condições necessárias para a produção dessas proteínas com o máximo rendimento, além de oferecer uma estratégia de construção de um sistema de expressão e secreção de proteínas em leveduras. Neste trabalho, mostra-se o perfil das proteínas extracelulares de culturas de Kluyveromyces lactis submetidas a estresse por nitrogênio. A técnica de cultivo em regime contínuo, aliada à análise proteômica, foi utilizada para investigar a resposta da cultura de K. lactis em duas velocidades de crescimento estabelecidas em função da concentração de nitrogênio, ou seja, 0,03 h-1 e 0,09 h-1. A velocidade de crescimento de 0,09 h-1 mostrou o maior rendimento na produção de proteínas extracelulares (1,54 mg.L-1), maior conversão de glicose em proteína (3,3 x 10-4 g.g-1) e um maior rendimento de biomassa (0,13 g.g-1). Através da análise dos perfis protéicos em SDS-PAGE gradiente de amostras dos extratos extracelulares nas duas velocidades de crescimento, pôde-se distinguir, inicialmente, diferenças no proteoma de culturas de K. lactis. A velocidade de 0,09 h-1 apresentou maior número de bandas quando comparada com o perfil obtido para 0,03 h-1. Na identificação proteômica das bandas excisadas do gel por espectrometria de massa em MALDI-TOF-TOF-MS, os espectros obtidos foram analisados utilizando-se o software MASCOT®. As proteínas sugeridas por essa análise estão relacionadas a processos de ciclo celular, replicação, transcrição, mudanças pós-traducionais, metabolismo de carboidrato, ubiquitinação e degradação celular e são comumente encontradas no interior celular. Os extratos extracelulares de K. lactis também foram analisados por cromatografia líquida bi-dimensional (LC-2D), na qual a velocidade específica de crescimento de 0,09 h-1 apresentou maior número de picos cromatográficos, resultado que indica a presença de maior número de proteínas nessa velocidade com relação a 0,03 h-1. Nas várias análises por espectrometria de massa em MALDI-TOF-TOF-MS, das amostras advindas da cromatografia líquida 2D, obteve-se um total de 95 massas moleculares nas duas velocidades específicas de crescimento; dessas massas, aproximadamente 30% pertencem às amostras da velocidade específica de crescimento de 0,03 h-1 e 70%, à velocidade específica de crescimento de 0,09 h-1. A análise por espectrometria de massa também evidenciou a presença de glicosilações (moléculas de N-acetilglicosamina e de 8 a 15 moléculas de hexose por proteína) e de outras possíveis mudanças pós- traducionais em amostras resultantes da LC-2D de ambas as velocidades específicas de crescimento. Na identificação das proteínas extracelulares, as amostras, obtidas na LC-2D das duas velocidades específicas de crescimento, foram tripsinolizadas e analisadas novamente por espectrometria de massa, e as proteínas sugeridas pela análise foram aquelas de K. lactis ligadas ao trânsito de peptídios e ao metabolismo de carboidrato, enzimas de transcrição e outras enzimas, como transferases, cinases, hidrolases, descarboxilases, oxidases e mutarotases, do mesmo modo que na avaliação anterior; e essas proteínas não obtiveram os scores mínimos para a identificação por homologia ser considerada estaticamente significativa.